Скрининг клеточной смерти с использованием окрашивания DAPI: метод быстрого скрининга ИК-индуцированной клоногенной гибели клеток в раковых клеточных линиях

Аннотация

Источник: Kobayashi, D. et al. Одношаговый протокол для оценки режима радиационно-индуцированной клоногенной гибели клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует методологию скрининга основных профилей гибели клеток в индуцированных ионизирующим излучением (ИК) линиях раковых клеток с использованием анализа окрашивания DAPI. Окрашенные DAPI ядра клеток-мишеней, подвергающихся клеточной гибели, демонстрируют четкую морфологию и могут быть легко идентифицированы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол

1. Подготовка материалов

1. Автоклавные покровные стекла
   1. Поместите покровные стекла в стеклянный стакан.
   2. Накройте стеклянный стакан фольгой.
   3. Автоклав при 121 °C при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мин.
   4. Сушить при температуре 50 °C. Хранить при комнатной температуре в культурном колпаке.
2. Приготовьте раствор для фиксации: 3% параформальдегид + 2% сахароза в фосфатно-солевом буфере (PBS)
   1. В стеклянный флакон объемом 1000 мл добавьте 700 мл PBS и 30 г параформальдегида.
      осторожность: Параформальдегид вызывает коррозию, надевайте соответствующие перчатки.
   2. Параформальдегид полностью растворить, нагрев до 80 °C с помощью микроволновой печи><. осторожность: Пары параформальдегида токсичны, носите маску.
   3. Оставьте при комнатной температуре на ночь.
   4. Добавьте 20 г сахарозы.
   5. Добавьте PBS, чтобы получить общий объем 1 л.
   6. Аликвота в пробирках по 50 мл. Фиксирующий раствор может храниться в течение 3 лет при температуре -20 °C или в течение 3 месяцев при 4 °C.

2. Облучение

ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с рентгеновским облучателем осторожно в соответствии с инструкциями производителя.

1. Рассмотрите клетки под микроскопом с инвертированной фазой. Убедитесь, что ячейки прикреплены к покровному листу и находятся в живом состоянии.
2. Облучите чашку рентгеновскими лучами 6 Гр (1,4 Гр/мин, 300 КВП, 20 мА).
3. Инкубировать в течение 72 ч при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO₂,
   заметка: Время инкубации может быть изменено в соответствии с планом эксперимента

3. Фиксация

1. Отсадите питательную среду из чашки.
2. С помощью ножниц отрежьте кончик наконечника микропипетки объемом 1 000 л на расстоянии 5 мм от конца.
   заметка: Кончик разреза помогает плавно наносить фиксирующий раствор.
3. С помощью срезанного кончика добавьте 1 мл раствора для фиксации (приготовленного на шаге 1.2) в блюдо с боковой стенки посуды.
   заметка: Этот шаг чувствителен ко времени и поэтому должен выполняться без замены наконечников микропипеток при работе с несколькими образцами. Нанесение фиксирующего раствора непосредственно на дно посуды может повредить клетки.
4. Поместите блюдо в квадратную посуду для культуры. Осторожно встряхните квадратную чашку для посева, чтобы равномерно распределить фиксирующий раствор по покровному стеклу.
5. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
6. Раствор для фиксации аспирата из чашки.
7. Добавьте 2 мл PBS в блюдо с боковой стенки блюда.
   заметка: Нанесение PBS непосредственно на дно посуды может повредить клетки.
8. Отсадите PBS из чашки.
9. Повторите шаги 3.7 и 3.8 дважды.
   заметка: Посуду можно хранить в течение 1 недели при температуре 4 °C, при этом покровные стекла должны быть погружены в 2 мл PBS.

4. Окрашивание DAPI

1. На предметное стекло нанесите 5 μL 1 μг/мл окрашивающего реагента DAPI.
   заметка: Окрашивающий реагент DAPI стабилен в течение 6 месяцев при хранении в защищенном от света месте при температуре -20 °C или ниже.
2. С помощью скальпеля снимите покровный лист с посуды.
3. Удалите излишки PBS с покровного стекла, коснувшись края покровного стекла бумажным полотенцем.
4. Установите покровное стекло вверх ногами на каплю окрашивающего реагента DAPI на предметном стекле так, чтобы клетки подвергались воздействию окрашивающего реагента DAPI.
   заметка: Этот шаг чувствителен ко времени. Высыхание реагента для окрашивания DAPI может привести к неоптимальному окрашиванию.
5. Образцы могут храниться в течение 1 года при температуре -20 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Крышка	Мацунами	C013001
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	П6148-1КГ
сахароза	Сигма-Олдрич	84097-250Г
Фосфатно-солевой буфер	Космо Био	16232000
скальпель	Кай Медикал	No20, 520-А
Чашка для клеточных культур 35 мм	сокол	353001
Инвертированный фазовый микроскоп	Симадзу	Телефонный номер 114-909
Рентгеновский облучатель	Факситронная биоптика	Факситрон RX-650
Квадратное блюдо для культуры	Корнинг	No 431110
Слайд-стекло	Мацунами	Про-11
Реагент для окрашивания DAPI	Клеточная сигнализация	8961С
Флуоресцентный микроскоп	Компания Nikon	ЗАТМЕНИЕ Ni
флуоресцентный микроскоп DAPI фильтр	Компания Nikon	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
Объектив флуоресцентного микроскопа (20×)	Компания Nikon	План Apo λ 20X/0.75
Объектив флуоресцентного микроскопа (60×, масло)	Компания Nikon	План Apo λ 60X/1.40 масло
масло	Олимп	N5218600
ПЗС-камера	Компания Nikon	ДС-Ки2
Программное обеспечение для получения цифровых изображений	Компания Nikon	Документ NIS-Elements
очиститель объектива	Олимп	ОТ0552
хлороформ	Вако	035-02616 (Английский

)