Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Получение децеллюляризованного пищеводного каркаса
- Получите неповрежденные свиные пищеводы на скотобойне из свежезабитых свиней породы ландрас, которые используются для производства продуктов питания. Один единственный пищевод обеспечит достаточное количество скаффолдов примерно для 30 отдельных конструкций.
заметка: Из-за обширного и трудоемкого протокола стерилизации, как правило, стоит получить и обработать не менее 10 эзофагов за один раз.
- Немедленно поместите только что иссеченный пищевод в стерильную кастрюлю объемом 180 мл, содержащую примерно 150 мл 10% раствора повидон-йода на 5 минут, чтобы снизить любую загрязняющую микробную нагрузку. Переложите пищевод во второй горшок, содержащий приблизительно 100 мл стерильного PBS, содержащего 200 МЕ/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 1,25 мкг/мл амфотерицина В.
- Установите на место крышку контейнера и транспортируйте пищевод обратно в лабораторию при комнатной температуре. В каждом контейнере можно перевозить два или три эзофаги, в зависимости от их размера.
- Оказавшись в лаборатории, обработайте ткань в ламинарном проточном колпаке с использованием асептического метода, чтобы свести к минимуму микробное загрязнение. Простерилизуйте пинцет, ножницы и лезвия скальпеля, замочив в течение 5 минут в 70% этаноле и прополоскав в стерильном PBS.
- Обработайте пищевод с помощью стерильного пинцета. С помощью ножниц разрежьте пищевод в продольном направлении. Промойте салфетку, поместив пищевод в стерильный горшок объемом 180 мл, содержащий примерно 100 мл стерильного PBS, и осторожно встряхните, чтобы удалить любой мусор.
- Очистите пробковую доску для вскрытия, обильно распылив 70% этанола, и дайте высохнуть.
- Извлеките пищевод из ПБС, и с помощью стерильных игл приколите пищевод к доске, поверхность слизистой вверху. Возьмитесь за поверхность слизистой оболочки на одном конце пищевода стерильным пинцетом и оторвите от доски. Это отделит слизистую оболочку от нижележащей подслизистой оболочки.
- Затем с помощью стерильного лезвия скальпеля рассеките пищевод в продольном направлении вдоль собственной пластинки, удаляя штифты по мере рассечения, чтобы позволить приподнять слизистую оболочку.
- Сохраните рассеченную слизистую оболочку и отбросьте подлежащую подслизистую.
- Отрежьте и отбросьте наиболее проксимальные и дистальные 2 см слизистой оболочки, так как на этих участках находится большее количество подслизистых желез и более толстая собственная пластинка.
- С помощью скальпеля разрежьте оставшуюся ткань на 5 см2 . Поместите всю разрезанную ткань в стерильную кастрюлю объемом 180 мл, содержащую примерно 150 мл стерильного PBS, и осторожно взбалтывайте, чтобы промыть ткань. Если вы обрабатываете более пяти эзофагов за один раз, может потребоваться использовать несколько горшков для этого и трех последующих этапов.
- С помощью стерильного пинцета перенесите разрезанную ткань в горшок объемом 180 мл, содержащий 150 мл стерильного 1 М NaCl, 200 МЕ/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 1,25 мкг/мл амфотерицина В. Инкубировать в течение 72 ч при 37 °С. Инкубировать в течение 72 ч при 37 °С.
- Поместите салфетку в свежую кастрюлю объемом 180 мл, содержащую 150 мл стерильного PBS. Эпителий начнет заметно отделяться от подлежащей ткани. Аккуратно отслоившийся эпителий от пищевода свиньи с помощью стерильных щипцов и выбросьте.
- Поместите оставшуюся ткань в свежую кастрюлю объемом 180 мл и добавьте 150 мл стерильного PBS. Аккуратно помешивать 5 минут для стирки. Слейте PBS и повторите еще два раза со свежими PBS.
- Поместите всю ткань в стеклянный флакон объемом 500 мл, содержащий 400 мл стерильного 80% раствора глицерина на 24 ч при комнатной температуре. Перенесите в 400 мл стерильный 90% раствор глицерина еще на 24 ч.
- Хранить в 400 мл стерильного 100% раствора глицерина при комнатной температуре не менее 4 месяцев для обезвоживания и стерилизации ткани с сохранением целостности базальной мембраны.
