Экстракция экзосом на основе магнитных шариков: метод выделения специфических экзосом из биожидкостей

Аннотация

Источник: Tu, M. et al. Обнаружение экзосомальных биомаркеров с помощью высвобождения и измерения, вызванного электрическим полем (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем процедуру выделения экзосом из целевых биожидкостей с помощью магнитных микрогранул. Эта процедура позволяет быстро захватывать экзосомы, которые могут быть использованы для последующего анализа.

Протокол

1. Экстракция экзосом на основе магнитных шариков

1. Пипеткой нанесите хорошо перемешанный раствор 5 мкл магнитных микрочастиц, покрытых стрептавидином, в 495 мкл буфера с фосфатно-солевым буфером (PBS) в микроцентрифужной пробирке для ресуспендирования шариков. Промойте и повторно суспензируйте шарики 500 μл PBS три раза с помощью магнитного штатива. Штатив представляет собой массив магнитов на боковой стороне корпуса, который может удерживать пробирки микроцентрифуги для образцов.
   1. Для каждой промывки сначала дайте пробиркам постоять на решетке в течение 1 минуты, а затем с помощью наконечника пипетки осторожно удалите буфер надосадочной жидкости, не потревожив шарики.
   2. Поместите пробирки на обычную решетку без магнитов сбоку. Добавьте 500 μL PBS в пробирки и с помощью пипетки смешайте раствор и шарики. Затем поместите трубки обратно на магнитную решетку, чтобы снова отделить шарики от раствора.
   3. Выполните это удаление буфера с помощью намагниченности и ресуспендирования в PBS в общей сложности три раза. При этом выполняется первоначальная промывка магнитных частиц.
2. Суспендируйте шарики в буфере PBS объемом 490 μл, поместив трубку на ненамагниченную часть магнитного штатива. Пипеткой вносите 5 мкл биотинилированного антитела мыши к человеческому CD63 в концентрации 1,0 мг/мл в смесь шариков. С помощью пипетки смешайте шарики и антитела в растворе.
3. Поместите микроцентрифужные пробирки с шариком и смесью биотинилированных антител на вращатель образца. Установите параметры вращателя образца для возвратно-поступательного вращения на 90°, наклона на 5 с и вибрации под углом 5° в течение 1 с. Вращайте трубки с образцом и бусиной при этих параметрах в течение 30 минут при RT.
4. Удалите несвязанные антитела после конъюгации.
   1. После 30 минут вращения в режиме RT поместите трубки обратно в магнитную стойку на 5 минут.
   2. Выполните три промывки шариков, удалив жидкую фазу с помощью микропипетки, и промойте 500 мкл PBS. После тройной стирки снова суспендируйте шарики в 490 мкл казеина-PBS и поместите их на ненамагниченную часть штатива.
5. Экстракция экзосом с помощью гранул, покрытых антителами.
   1. Пометьте каждую пробирку идентификатором целевого образца. Пипеткой введите образец сыворотки или слюны объемом 10 мкл в микроцентрифужную пробирку. С помощью пипетки смешайте образец и магнитные шарики путем пипетирования несколько раз.
   2. Поместите пробирки с образцом и гранулами антител к человеческому CD63 на ротатор и вращайте в течение 2 ч в режиме РТ. Используйте те же параметры ротатора, что описаны в шаге 1.3.
   3. После 2 ч вращения образца выполните тройную промывку путем намагничивания для отделения шариков от раствора, удаления жидкой фазы с помощью микропипетки и повторного суспендирования шариков в 500 мкл буфера Tris-HCl. Полученные шарики теперь связаны с экзосомами и готовы к высвобождению и измерению электрического поля.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биотинилированное антитело к CD63 человека	Ancell, США	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, США	65601
Неодиниевые магнетики (диаметр 1/10 дюйма x толщина 1/32 дюйма)	K&J Magnetics, США	DH101
Сверхчистая дистиллированная вода	Life Technologies, США	10977-023
Anti-Fluorescein-POD, Fab фрагменты	Roche, Германия	11426346910
Фосфатно-солевой буферный раствор	Life Technologies, США	10010023
Казеин/ПБС	Fisher Scientific, США	No 37532