$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Переваривание тканей
- С помощью планшета для культуры тканей диаметром 100 мм механически измельчите ткань на мелкие кусочки размером ~1–2 мм с помощью стерилизованных автоклавом ножниц и хирургических щипцов (рис. 1B, C). Соединительная ткань между частями должна быть разрезана, чтобы обеспечить правильное разделение и облегчить дальнейшие шаги.
- Добавьте 6 мл раствора диспазы/коллагеназы в измельченную ткань. Затем инкубировать при 37°C в течение примерно от 30 минут до 1 часа.
- Нарушьте работу тканей путем пипетирования серологической пипеткой объемом 5 мл 15–20 раз.
- Выдерживать при температуре 37°C еще от 30 минут до 1 часа.
- Повторите шаги 1.3 и 1.4 еще два-три раза или до тех пор, пока ткань не станет похожа на кашицу и не сможет легко пройти через отверстие пипетки (рисунок 1D).
заметка: От исходного размера образца ткани и тонкости измельчения ткани будет зависеть, сколько раз нужно будет повторить шаги 1.3 и 1.4. Как правило, мы получаем ткань размером примерно 1 см х 1 см. Кроме того, можно контролировать диссоциацию тканей с помощью стандартного микроскопа инвертированной культуры тканей, чтобы отслеживать прогресс диссоциации клеток из ткани. Небольшие скопления клеток идеально подходят для первоначального разрастания клеток слюны в виде салисфер.
2. Покрытие колодцев матрицей базальной мембраны
ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица базальной мембраны (BMM) должна быть разморожена за ночь до 4°C за день до ее использования. После оттаивания BMM следует постоянно поддерживать на льду или при температуре 4°C, так как он быстро затвердевает (т.е. образует гель) при более высоких температурах. Кроме того, следует соблюдать осторожность, если образцы были охлаждены на льду перед нанесением покрытия на BMM, так как холодные образцы «расплавят» BMM и подвергнут клетки воздействию пластиковой чашки.
- Медленно пипетируйте BMM (см. Таблицу материалов) в каждую лунку, на которую наносится покрытие. Равномерно и медленно распределите BMM по лунке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мы используем 500 мкл на каждую лунку 6-луночного планшета, но этот объем может быть отрегулирован для использования на других вариантах планшетов, таких как 12-луночные или 24-луночные, или по желанию для более густых или более жидких гидрогелей.
- Инкубируйте пластины с покрытием при температуре 37°C не менее 15 минут перед использованием, чтобы дать BMM время застыть.
3. Фильтрация непереваренной ткани, лизис эритроцитов и покрытие клеток
- Перенесите тканевый гомогенат с шага 1,5 в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте планшет один раз 6 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) для переноса оставшихся клеток.
- Отфильтруйте гомогенат в коническую пробирку объемом 50 мл через нейлоновое сетчатое сетчатое фильтр 70 мкм, чтобы удалить непереваренную ткань. Центрифуга напрягла клетки в течение 5 мин при давлении 500 x g.
- Разведите 10x буфер для лизиса эритроцитов в стерильном dH2O до получения 1x рабочего раствора.
- Аспирируйте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте клеточную таблетку в 10 мл 1x буфера для лизиса эритроцитов. Выдерживать 5 минут при температуре 37°C.
- Добавьте 20–25 мл DPBS для нейтрализации буфера для лизиса эритроцитов и минимизации лизиса клеток слюны. Центрифуга в течение 5 мин при 500 г.<бр/>
заметка: После обработки буфером для лизиса эритроцитов клеточная гранула должна быть белого цвета. Красный цвет в грануле указывает на то, что не все эритроциты были полностью лизированы. При необходимости повторите шаги с 3.4 по 3.5 для полного лизиса всех эритроцитов.
- Аспирируйте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 1–2 мл BEGM на лунку, затем поместите ресуспендированные элементы в лунки с покрытием BMM. Инкубировать при 37°C.
- После нанесения на BMM клетки формируются в сферические структуры или «салисферы» в течение 2-3 дней. Клетки могут сохраняться в виде салисфер в течение примерно 5-7 дней, прежде чем BMM начнет деградировать, позволяя клеткам получать доступ к пластику и прилипать к нему и расти как монослой.