1. Подготовка зондов наночастиц
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе используются функционализированные золотые наностержни (AuNRs; диаметр 25 нм x длина 71 нм), которые ковалентно сопряжены с полимерами нейтравидина (AV) и имеют пик поверхностного плазмонного резонанса, который создает красный (пик 641 нм) рассеивающий сигнал при освещении DFM.
- Промыть 40 мкл AuNR-AV (2,56 x10 11 частиц) три раза с 200 мкл PBS (pH 7,0) путем центрифугирования и аспирации (8 500 x g при 4 °C в течение 10 минут), после чего заключительную стадию центрифугирования и аспирации, после чего гранулу AuNR-AV суспензируют в 40 мкл PBS.
- Смешайте эту суспензию AuNR-AV с 10 мкл биотинилированного антитела (0,5 мг/мл), специфичным для антигена на поверхности интересующего подтипа экзосомы, и 150 мкл PBS, а затем перемешайте при 4 °C в течение 2 ч с помощью смесителя, чтобы обеспечить полное связывание нейтравидина с биотином.
- Полученные конъюгированные антителами AuNR (AuNR-IgG) промыть три раза центрифугированием и аспирацией (6500 x g при 4 °C в течение 10 минут), а затем суспензировать их в 200 мкл PBS и хранить при 4 °C до использования><.
заметка: Необходимо использовать стерильную технику и короткие сроки хранения, чтобы избежать загрязнения и деградации AuNR-IgG. Лучше всего использовать конъюгированные антителами AuNR в течение 24 часов после их конъюгации.
2. Подготовка слайдов для захвата EV
- Разведите выбранные антитела захвата экзосом до 0,025 мг/мл в PBS и добавьте 1 мкл/лунку этого разведения на предметное стекло с многолуночным белком A/G, а затем инкубируйте это предметное стекло при 37 °C в течение 1 ч в увлажненной камере, чтобы обеспечить связывание антител захвата с белком A/G, иммобилизованным на предметном стекле.
- Аспирировать лунки для удаления несвязанных антител и промыть их трижды путем добавления и аспирации 1 μл/лунку PBS. Затем загрузите в каждую лунку 1 мкл блокирующего буфера (см. Таблицу материалов) и инкубируйте предметное стекло в течение 2 часов при 37 °C в увлажненной камере, чтобы заблокировать любые оставшиеся участки связывания белка.
- Аспирация лунок для удаления блокирующего буфера, трижды промывка лунок добавлением и аспирацией 1 мкл/лунка PBS и немедленное использование заблокированных стекол для захвата и анализа экзосом.
3. Подготовка стандартной кривой
- Чтобы точно количественно оценить абсолютную или относительную распространенность конкретного подтипа экзосомы, пользователь должен построить стандартную кривую с чистой популяцией экзосом, которая равномерно выражает интересующий нас поверхностный биомаркер экзосомы. В этом исследовании анализируется обилие экзосом, экспрессирующих мембранный белок, связанный с метастазированием, рецептор эфрина А2, который, как сообщается, связан со стадией рака поджелудочной железы и прогнозом><.
заметка: Известно, что клеточная линия рака поджелудочной железы человека PANC-1 и ее экзосомы экспрессируют этот белок, и выделенные экзосомы из этой клеточной линии были использованы для создания стандартной кривой для количественной оценки количества экзосом, экспрессирующих этот белок в сложных образцах экзосом.
- Культивируют клетки в течение 48 часов при 37 °C в бессывороточных питательных средах, чтобы обеспечить накопление экзосом в средах, затем выделяют надосадочную жидкость клеточных культур путем центрифугирования суспензионных культур или прямой аспирации питательных сред из адгезивных клеточных культур.
- Центрифугируйте собранную среду при давлении 2000 x g в течение 30 минут, чтобы удалить мусор и восстановить надосадочную жидкость.
- Осветленную надосадочную жидкость для культур отфильтруйте через фильтрующую установку с низким содержанием связывания белка с низкой пропускной способностью 0,45 мкм соответствующей производительности (например, вакуумную установку для фильтрации полиэфирсульфонов объемом 250 мл).
- Концентрируйте полученный фильтрат путем центрифугирования при 3200 x g с использованием фильтрующей системы с предельным значением молекулярной массы 100 000 до конечного объема 250 мкл. Соберите оставшийся объем из этого фильтра, затем промойте фильтр 200 мкл PBS и объедините этот объем промывки с объемом собранного образца экзосомы.
- Центрифугируйте этот образец при давлении 21 000 x g в течение 45 минут и осторожно восстановите надосадочную жидкость, стараясь не собирать осажденный материал.
- Центрифугируйте восстановленную надосадочную жидкость при давлении 100 000 x g в течение 3 часов для осаждения экзосом. Отоберите надосадочную жидкость и соберите гранулу экзосомы в 100 мкл PBS.
- Полученные экзосомные суспензии хранят при температуре 4 °C при использовании в течение 24 часов или при -80 °C при длительном хранении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте образцы экзосом повторным циклам замораживания-размораживания.
- Количественное определение аликвоты экзосомной суспензии после смешивания путем прямого измерения числа экзосом (например, с помощью анализа отслеживания наночастиц или настраиваемого резистивного импульсного зондирования или путем измерения концентрации белка в лизатах экзосом с помощью анализа микробицинхониновой кислоты или эквивалентным методом в качестве средства приближения количества экзосом).
- Создание набора последовательных разведений экзосомной суспензии для сравнения сигнала наночастиц с входным числом экзосом или содержанием белка.
- Перенесите по 1 мкл каждого стандарта экзосомы в каждую из его репликационных лунок на пластине для анализа.
Стандартные кривые могут быть использованы для расчета наклона линии корреляции между сигналом наночастиц и концентрацией экзосом для (1) оценки эффективности анализа и (2) определения относительной концентрации целевых экзосом в экспериментальных образцах.
4. Обработка образцов плазмы или сыворотки человека
- Соберите образцы плазмы или сыворотки стандартными методами и храните при температуре -80 °C до тех пор, пока не потребуется анализ экзосом. Быстро разморозьте образцы на водяной бане комнатной температуры. Многократно перемешайте размороженные образцы путем инверсии, чтобы получить однородную суспензию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты исследований в образцах сыворотки и плазмы могут быть неэквивалентными, поскольку во время реакции свертывания происходит значительное высвобождение экзосом.
- Центрифугируйте образцы плазмы или сыворотки при давлении 500 x g в течение 15 мин для осаждения белковых агрегатов и другого мусора. Перенесите аликвоту образца плазмы или сыворотки в свежую пробирку и добавьте PBS для получения разведения в соотношении 1:1. Разбавленный образец перемешайте путем осторожного вортексинга или инверсии, в зависимости от ситуации. Перенесите по 1 мкл каждой плазменной или сывороточной суспензии в каждую из ее репликационных лунок на пластине для анализа.
5. Захват и обнаружение экзосом
- Загрузите в лунки заблокированного предметного стекла захвата EV 1 мкл/лунку образца экзосомы, используя 8 повторений на образец, и инкубируйте предметное стекло в течение ночи при температуре 4 °C в увлажненной камере. Отсадите все лунки образца, а затем добавьте 1 μл/лунку PBS для промывки лунок и удаления несвязанных экзосом и других загрязнений из загруженного образца экзосомы.
- Загрузите в лунки образца 1 мкл/лунку предварительно приготовленной суспензии AuNR-IgG (см. раздел 1 выше) и инкубируйте предметное стекло в течение 2 часов при 37 °C в увлажненной камере. Отсадите раствор наночастиц и промойте предметное стекло в PBS с добавлением 0,01% Tween-20 (PBST) в течение 10 минут с помощью смесителя, затем отасуньте и промойте все лунки образца деионизированной водой в течение 10 минут с помощью вращающегося смесителя и высушите на воздухе для последующей съемки LMDFM><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Межпробирные коэффициенты вариации (CV) оцениваются по восьми повторам одного и того же образца. Выборки, которые демонстрируют резюме >20%, считаются неинформативными и должны быть повторены при наличии достаточной выборки.
