$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка ЦОК
- Рассчитайте необходимое для инъекции количество ЦОК и приготовьте суспензию одиночных клеток в концентрации 1,0 ×10 4 клеток/мкл в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS). Поместите клеточную суспензию на лед или при температуре 4 °C в течение всей процедуры><.
заметка: При использовании клеточных линий, требующих трипсинизации, обязательно дважды промывайте клетки стерильным PBS для удаления трипсина. Выполните подсчет клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Если используется большая когорта (>50 мышей), пересчитайте клетки и проверьте жизнеспособность клеток между инъекциями, чтобы обеспечить постоянное количество клеток, вводимых на одну мышь.
2. Предоперационная процедура
- Подкожно вводите мышке 5 мг/кг бупренорфина с пролонгированным высвобождением (Bup-SR).
заметка: Не вводите инъекции в область предполагаемого разреза; Выберите место инъекции вдали от лопатки.
- Обезболивайте мышь 2–3% изофлураном до тех пор, пока у нее не исчезнут признаки корректирующего рефлекса. Кроме того, проверьте наличие рефлекса защемления хвоста и/или лапы, чтобы подтвердить состояние анестезии.
- Подготовьте мышь к операции в месте, удаленном от операционной зоны. Зафиксируйте место операции (т.е. тыльную поверхность черепа) с достаточной площадью границы, чтобы шерсть не загрязнила место разреза; Затем пропитайте участок бактерицидным кожным антисептиком, работая от центра участка к периферии, а затем дайте высохнуть. Наложите стерильную простыню или стерильную пластиковую простыню на клейкой основе, чтобы защитить место операции от загрязнения.
заметка: Инструменты должны быть предварительно автоклавированы, а наконечники повторно стерилизованы между животными с помощью стерилизатора со стеклянными шариками.
- Сбрейте шерсть всей брюшной поверхности головы и подготовьте кожу стерильной техникой
.
- Расположите нос с помощью модифицированного L-образного носового конуса стереотаксического аппарата, гарантируя, что ноздри останутся чистыми и открытыми. С помощью ленты на вентральных поверхностях обеих ушных раковин осторожно потяните кожу вперед, чтобы закрепить ее на носовом конусе, и согните шею под углом примерно 90° после фиксации. Ввести 1,5% изофлуран для поддержания анестезии.
заметка: Правильное позиционирование приведет к тому, что область разреза будет представлена таким образом, чтобы можно было легко идентифицировать каудальный гребень затылочной кости.
- Расположите тело так, чтобы позвоночник оставался на уровне цистерны magna, и, оказывая небольшое сцепление с хвостом, поместите ленту у основания хвоста для фиксации.
3. Хирургическая инъекция цистерны Magna
- Когда шея полностью выпрямлена, начиная прямо между ушными раковинами, проведите кончиками хирургических ножниц вниз с легким надавливанием на затылочную кость.
заметка: Находясь в этом положении по средней линии, заметно небольшое углубление, когда кончики ножниц погружаются в вогнутую область над большой цистерной.
- Сделайте небольшой разрез по средней линии размером 3–5 мм чуть выше пальпированной вогнутости. Наберите 5 мкл клеточной суспензии в концентрации 1,0 ×10 4 клеток/мкл (всего 5,0 × 104 клеток) в шприц Hamilton массой 30 г.
- С помощью щипцов с тупым наконечником и наконечниками 1–2 мм аккуратно надавите на цистерну магна. Введите кончики в закрытое положение и раскройте их, оказывая давление вниз на твердую мозговую оболочку.
- Повторяйте тупое рассечение, описанное на предыдущем этапе, до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не будет легко идентифицирована, а связанные с ней кровеносные сосуды не станут видны в открытой области><.
заметка: Полученное окно для инъекций гарантирует, что кровеносные сосуды не будут повреждены во время введения иглы.
- Держа щипцы открытыми, чтобы втянуть окружающую мускулатуру, введите иглу 30 G без отбора керна под твердую мозговую оболочку, чтобы визуализировать скос. Убедитесь, что игла введена только сразу за самим скосом. Медленно разверните поршень шприца и введите клетки чуть ниже твердой мозговой оболочки.
- Правильно расположите фаску, чтобы наблюдать за впрыском под твердую мозговую оболочку. Осторожно применяйте технику и используйте иглу без отбора керна 30 G, чтобы предотвратить повреждение мембраны и обеспечить минимальную утечку. Если наблюдается протекание, слегка надавите аппликатором с ватным наконечником.
- Закройте кожу, нанеся зажим для раны или микрокаплю клея для кожи. После успешного выполнения инъекции дайте мышам восстановиться после анестезии на теплом одеяле, непрерывно наблюдая за ними, пока они не смогут сохранять положение грудины и демонстрировать целенаправленные движения.
- Наблюдайте за мышами ежедневно после операции в течение первой недели. Если мышь испытывает боль или недомогание, обработайте ее подкожной инъекцией карпрофена в дозе 10 мг/кг один раз в 12–24 часа в течение 5 дней в соответствии с консультацией и предписанием ветеринара. Дайте мышам восстановиться и наблюдайте за ними в течение как минимум 48-72 часов, прежде чем переходить к следующему этапу.
заметка: Bup-SR, введенный в упреждающем порядке, действует до 72 ч, поэтому дополнительные анальгетики обычно не требуются. Тем не менее, животным будут предоставляться дополнительные анальгетики по мере необходимости (если они вялые, не едят, взъерошены). Если на месте операции появляются признаки послеоперационной инфекции (например, покраснение, отек, болезненность, аллодиния, гипералгезия, гиперпатия или нагноение) или если мышь охраняет пораженный участок, усыпьте мышь. При успешном введении раковых клеток в спинномозговую жидкость, ЛМД и опухолевая прогрессия разовьются в ЦНС в течение 1 или 2 недель (в зависимости от типов ЦОК или используемой клеточной линии) (Рисунок 1).
