Интрацеребровентрикулярная инъекция мышам: опосредованный Ommaya метод прямого введения лекарств для доставки лекарств в церебральные желудочки головного мозга мыши

Аннотация

Источник: Law, V. et al. Мышиная модель ксенотрансплантата Ommaya для изучения прямой таргетной терапии лептоменингеального заболевания. J. vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует опосредованную ommaya внутримозговую инъекцию в мышиной модели. Этот метод позволяет локализовать доставку потенциальных кандидатов в лекарственные препараты и обходит гематоэнцефалический барьер.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Сборка и имплантация мышиной Ommaya

1. Подготовка станции
   1. Продезинфицируйте поверхность станции. Накройте поверхность синим покрытием и держите наготове все стерилизованные инструменты и принадлежности, указанные на рисунке 1.
2. Предоперационная процедура
   1. Применяйте анальгезию (Bup-SR) и поддерживайте стерильную операционную среду.
3. Хирургическая имплантация мышей Ommaya
   1. Соберите инъекционное устройство Murine Ommaya с помощью миниатюрного инъекционного порта 25G (внешний диаметр 0,51 мм) и спейсерного диска диаметром 1 мм. Используйте стерильный цианоакрилатный адгезив, чтобы обеспечить проникновение примерно 2,5 мм металлической канюли в правое полушарие головного мозга (рис. 2A–C).
      заметка: В этой лаборатории был разработан совместимый с МРТ прототип мыши Ommaya, в котором обе части (миниатюрный порт для инъекции и спейсер) уже напечатаны на 3D-принтере как единое целое (рисунок 2D). Версия с одним блоком была протестирована с помощью МРТ и может сэкономить время за счет исключения этапа сборки.
   2. Обезболивайте мышь 2–3% изофлураном до тех пор, пока не исчезнут признаки выпрямляющего рефлекса. Далее проверьте наличие рефлекса защемления хвоста и/или лапы, чтобы подтвердить состояние анестезии.
   3. Выбрейте всю брюшную поверхность головы меха и подготовьте шкуру по стерильной методике. Поместите мышь в стереотаксический аппарат с носовым конусом для продолжения введения изофлурана во время процедуры; Уменьшите уровень изофлурана до 1,5%. Аккуратно затяните ушные планки, чтобы зафиксировать голову, и нанесите смазку для глаз, чтобы закрыть глаза мыши.
   4. Сделайте небольшой разрез кожи (3 мм) с последующим тупым рассечением подлежащих подкожных тканей, чтобы обнажить череп. Высушите череп с помощью пропитанных перекисью водорода аппликаторов с ватным наконечником.
   5. Просверлите отверстие для заусенцев в черепе на 0,5 мм сзади и на 1,1 мм латеральнее брегмы - анатомическую точку на черепе, где корональный шов перпендикулярно пересекается сагиттальным швом (рис. 2А), а также отверстие для заусенцев 0,9 мм, чтобы обнажить твердую мозговую оболочку. Отодвиньте микросверло в сторону и аккуратно надрежьте кость, непосредственно окружающую отверстие для заусенца, прежде чем вставлять инъекционный порт (глубиной около 2,5 мм), прикрепленный к черепу с помощью стерильного клея с цианоакрилатом. Нанесите шов вокруг места инъекции с помощью нейлоновых швов 4-0 без амортизации в виде прерывистого стежка или кисетного шва.
   6. Размещение мышей после операции в индивидуальных клетках для восстановления после операции.
      заметка: Вполне возможно, что мышиная мышь Ommaya может оторваться, когда несколько мышей, восстановленных после операции, содержатся в одной клетке, возможно, из-за постоянного взаимодействия с вмешательством. Рекомендуется, чтобы мыши, имплантированные Murine Ommaya, содержались по отдельности (или не более чем по 2 мышам в клетке) в течение всего испытания эффективности препарата.

2. Лечение мышиной оммайи

1. Дозирование мышей с помощью Murine Ommaya
   1. Обезболивайте мышь 2–3% изофлураном, пока не исчезнут признаки выпрямляющего рефлекса. Кроме того, проверьте наличие рефлекса защемления хвоста и/или лапы, чтобы подтвердить поддержание анестезии.
   2. Доступ к Murine Ommaya осуществляется с помощью адаптера для инъекций порта и шприца Hamilton. С помощью щипцов удерживайте верхнюю часть миниатюрного порта для инъекций и аккуратно введите адаптер инжектора порта полностью в перегородку порта.
      заметка: Инжектор порта прокалывает перегородку порта таким образом, что сокращает мертвое пространство до минимума и позволяет осуществлять контролируемый впрыск с помощью моторизованного шприцевого насоса (Рисунок 3A). Таргетные/новые методы лечения вводятся со скоростью потока 1 мкл/мин во время анестезии. Лечение должно проводиться через определенные промежутки времени (ежедневно/еженедельно) в течение установленного периода времени (недели/месяцы), по усмотрению исследователя.
      Объем от 3 до 7 мкл является оптимальным, так как объем <3 мкл ненадежен, а объем >7 мкл может вызвать слишком большое давление. Размер шприца Гамильтона может варьироваться от 10 до 100 мкл, в зависимости от количества мышей в каждой группе лечения. Предварительная загрузка соответствующего объема в шприц Hamilton предотвратит повторную замену шприца, тем самым минимизируя ошибки. Лучше всего выделять 1 шприц Гамильтона на каждую руку для лечения.
   3. После того, как инъекция будет сделана, отсоедините мышь Ommaya от адаптера для инъекции порта с помощью щипцов и верните мышь в клетку для восстановления после анестезии.

Результаты

Рисунок 1: Пример конфигурации рабочей станции для проведения имплантации Murine Ommaya мышам. (1) Аппарат для газовой анестезии/испаритель. (2) Стерильная синяя бумажная драпировка, закрывающая стереотаксическую подставку. (3) Стереотаксическое устройство (стойка/сцена, ушные планки, носовой обтекатель). (4) Микробур. (5) Лупа со светом. (6) Стерильные ватные палочки-аппликаторы со стерильным контейнером для полоскания солевым раствором. (7) Перекись в...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Распорный диск 1 мм	Алзет, Корпорация Durect	#0008670	Только распорный диск
4-0 Ethilon нейлоновый шов	Любой поставщик
Автоматические шприцевые насосы	Гарвардские шприцевые насосы (или любой другой поставщик)	#70-4505	Насос 11 Элит
Стерилизатор шариков	Braintree Scientific Inc. (или любой другой поставщик)	#GER 5287-120В	Проращиватель 500
Бупренорфин с пролонгированным высвобождением (Bup-SR)	Зоофарм		Управление по борьбе с наркотиками (DEA)
Цианоакрилатный стерильный клей	Любой поставщик
Система ингаляционной анестезии	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Микролитровые шприцы Hamilton	Гамильтон		10, 25, 50 и 100 μл; <бр/> 30G для инъекций cisterna magna
перекись водорода	Любой поставщик
Система визуализации IVIS 200	Штангенциркуль для медико-биологических наук
Лупа со светом	Любой поставщик
Микродрель	Stoelting (или любой другой поставщик)	#51555M
Визуализация МРТ	Брукер	Серия BioSpec	необязательный
Прототип Murine Ommaya (совместимый с МРТ)	Instech Laboratories, Inc.	#VAB620-25МРТ-3,3
Инжектор PinPort	Instech Laboratories, Inc.	#PNP3M-50
ПинПорт	Instech Laboratories, Inc.	#1-PNP3F28-50
Хирургические инструменты для грызунов (ножницы, щипцы)	Хирургический инструмент Roboz (или любой поставщик)
Стереотаксическое устройство	Stoelting (или любой другой поставщик)	#51730M
Стерильная синяя бумажная/драпировочная накладка	Любой поставщик
Стерильные ватные палочки	Любой поставщик