Модель глиомы, меченной люциферазой: опосредованный лентивирусом метод получения стволовых клеток глиомы, меченных люциферазой, для терапевтических исследований in vitro

Аннотация

Источник: Hu, Z. et al. Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует создание меченых люциферазой стволовых клеток глиомы с помощью лентивирус-опосредованной доставки генов. Люцифераза действует как репортерный ген и помогает облегчить быстрые эксперименты по скринингу лекарств.

Протокол

1. Подготовка GSC с люциферазой

1. Начните с культивирования GSC и центрифугируйте при 70 x g в течение 3 минут при комнатной температуре.
2. Удалите надосадочную жидкость и расщепите клетки с аккутазой в течение 4 минут при 37 °C. Используйте наконечник объемом 200 мкл и пипетку несколько раз для диссоциации и ресуспендирования клеточной гранулы.
3. Разбавьте клетки до 2 x 10⁵ клеток на лунку в 12-луночном планшете для культивирования и культивируйте клетки в течение ночи.
4. Добавьте 30 мкл супернатанта вируса люциферазы-EGFP (титр >10⁸ TU/мл) в каждую лунку планшета, а затем центрифугируйте клетки при 1000 x g в течение 2 ч при 25 °C. Культивируйте клетки в течение ночи.
5. Обновите среду на следующий день и культивируйте клетки в течение еще 48 часов.
6. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить появление GFP-положительных клеток.
7. Используйте проточный сортировщик ячеек для сортировки и отбора GSC с высокой флуоресценцией GFP для дальнейшего культивирования клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
В-27	Gibco	17504-044	В 50 раз
ЭФР	Gibco	PHG0313	20 нг/мл
ФГФ	Gibco	PHG0263	20 нг/мл
Глута Макс	Gibco	35050061	В 100 раз
Нейробазальный	Gibco	21103049	В 1 раз
Пенициллин-стрептомицин	ГиКлон	SV30010	P: 10 000 ед/мл S: 10 000 мкг/мл
Пируват натрия	Gibco	2088876	100 мМ