Клеточный биолюминесцентный анализ: высокопроизводительный метод комбинаторного скрининга лекарственных средств

Аннотация

Источник: Hu, Z. et al. Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента.J. Vis. Exp.(2021)

В этом видео мы описываем метод, подчеркивающий полезность биолюминесцентного анализа для чувствительного и быстрого скрининга лекарств. Эти препараты могут быть протестированы по отдельности или в комбинации для оценки синергизма в их механизме действия.

Протокол

1. Измерение жизнеспособности клеток на основе биолюминесценции

1. Покрытие планшетов смесью внеклеточного матрикса (ВКМ) (например, Матригель): Добавьте 40 мкл смеси ЭКМ 0,15 мг/мл в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение 1 ч при 37 °C. Удалите излишки смеси ВКМ и осторожно промойте один раз PBS.
2. Добавьте 100 мкл питательной среды, содержащей 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 и 500 клеток XG387-Luc, вместе со 100 л пустой среды в качестве контроля, в каждую лунку для 6 репликаций в 96-луночном оптическом планшете и культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C.
3. Удалите надосадочную жидкость, добавьте в каждую лунку 50 мкл питательной среды, содержащей 150 нг/мкл D-люциферина, и инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 °С.
4. Получите изображения клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS. Используйте встроенное программное обеспечение для создания нескольких круговых областей области интереса (ROI) и количественной оценки клеточной биолюминесценции.

2. Лечение темозоломидом и комбинированный скрининг

1. Перед обработкой нанесите предварительный слой на четыре 96-луночных планшета, как описано выше на этапе 1.
2. Высейте клетки XG387-Luc с плотностью 1000 клеток в культуральную среду объемом 100 мкл в каждую лунку 96-луночного оптического планшета и культивируйте клетки в течение ночи.
3. Заранее приготовьте темозоломид и целевые агенты из исходного раствора. Готовят серию концентраций, состоящую из 800 мкМ, 600 мкМ, 400 мкМ, 300 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ и 50 мкМ темозоломида в культуральной среде для обработки монопрепаратом. Разведите темозоломид и целевые агенты в исходном растворе в питательной среде соответственно для получения конечных концентраций 200 мкМ и 2 мкМ для скрининга комбинированных лекарственных средств (Список материалов).
4. Удалите питательную среду, когда большая часть ГСК прилипнет к дну планшетов; добавьте вышеподготовленную среду, содержащую темозоломид, в каждую лунку для трех технических повторений за одну обработку.
5. Для обработки темозоломида и скрининга комбинаций препаратов удаляют пустую среду и добавляют в каждую лунку вышеподготовленную среду, содержащую либо 200 мкМ темозоломид, либо 2 мкМ таргетного агента, либо комбинацию того и другого, для трех технических повторений за одну обработку.
6. Инкубируйте все планшеты при 37 °C, 5% CO₂ в течение 3 дней.
7. Удалите лекарственную среду, добавьте в каждую лунку 50 мкл пустой среды, содержащей 150 нг/мкл D-люциферина, и инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 °С.
8. Получите изображения клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS. Используйте встроенное программное обеспечение для создания нескольких круговых ROI и количественной оценки клеточной биолюминесценции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
В-27	Gibco	17504-044	В 50 раз
ЭФР	Gibco	PHG0313	20 нг/мл
ФГФ	Gibco	PHG0263	20 нг/мл
Глута Макс	Gibco	35050061	В 100 раз
Нейробазальный	Gibco	21103049	В 1 раз
Пенициллин-стрептомицин	ГиКлон	SV30010	P: 10 000 ед/мл S: 10 000 мкг/мл
Пируват натрия	Gibco	2088876	100 мМ
АБТ-737	MCE		Селективный и миметический ингибитор BH3 Bcl-2, Bcl-xL и Bclw
Адавосертиб (МК-1775)	MCE		Ингибитор Wee1
Акситиниб	MCE		Многоцелевой ингибитор тирозинкиназы
AZD5991	MCE		Ингибитор Mcl-1
А 83-01	MCE		Мощный ингибитор киназы ALK5 рецептора TGF-β I типа
CGP57380	Селлек		Мощный ингибитор MNK1
Дактолизиб (BEZ235)	Селлек		Двойной ингибитор ATPcompetitive PI3K и mTOR
Дазатиниб	MCE		Двойной ингибитор тирозинкиназы семейства Bcr-Abl и Src
Эрлотиниб	MCE		Ингибитор тирозинкиназы EGFR
Гефитиниб	MCE		Ингибитор тирозинкиназы EGFR
Линифаниб	MCE		Многоцелевые ингибиторы семейства VEGFR и PDGFR
Маситиниб	MCE		Ингибитор c-Kit
МЛ141	Селлек		Неконкурентный ингибитор Cdc42 ГТФазы
ОСИ-930	MCE		Многоцелевой ингибитор Kit, KDR и CSF-1R
Палбоциклиб	MCE		Селективный ингибитор CDK4 и CDK6
СБ 202190	MCE		Селективный ингибитор p38 MAP киназы
Бромид сепантрония (YM-155)	MCE		Ингибитор Сурвивина
ТКС 359	Селлек		Мощный ингибитор FLT3
УМИ-77	MCE		Селективный ингибитор Mcl-1
4-гидрокситамоксифен (афимоксифен)	Селлек		Селективный модулятор рецепторов эстрогена (ЭР)