Выделение внеклеточных везикул, происходящих из микроглии, на основе SEC: метод выделения внеклеточных везикул из кондиционированных питательных сред микроглии

Аннотация

Источник: Lemaire, Q. et al. Характеристика внеклеточных везикул, полученных из иммунных клеток, и изучение функционального влияния на клеточную среду. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео описывает метод, основанный на эксклюзионной хроматографии (SEC) для выделения внеклеточных везикул или EV, полученных из иммунных клеток мозга - микроглии. ВВ действуют как молекулярный груз для доставки медиаторов, которые регулируют иммунный ответ. Таким образом, выделенные ВВ могут быть использованы в качестве модели in vitro для изучения перекрестных помех микроглии и нейронов во время иммунного ответа нейронов.

Протокол

1. Первичная культура микроглии/макрофагов

1. Первичная культура микроглии
   1. Культивирование коммерческой первичной микроглии крыс (2 x 10⁶ клеток) (см. Таблицу материалов) в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM) с добавлением 10% сыворотки без экзосом, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 9,0 г/л глюкозы при 37 °C и 5%_CO2.
   2. Соберите кондиционированную среду после 48 ч посева и приступайте к изоляции ВВ.
2. Первичная культура макрофагов
   1. Культивировать первичные макрофаги коммерческих крыс (1 x 10⁶ клеток) в среде, предоставленной производителем (см. Таблицу материалов) при 37 °C и 5%_CO2, с сывороткой, не содержащей экзосом.
   2. Соберите кондиционированную среду после 24-часового посева и приступайте к изоляции ВВ.

2. Изоляция электромобилей

1. Предварительная изоляция электромобилей от кондиционированной среды
   1. Переложите кондиционированную питательную среду из культур микроглии или макрофагов (шаги 1.1.2 или 1.2.2) в коническую пробирку.
   2. Центрифугируйте при давлении 1 200 x g в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) для гранулирования ячеек.
   3. Переложите надосадочную жидкость в новую коническую трубку. Центрифугируйте при 1 200 x g в течение 20 мин при RT для устранения апоптотических тел.
   4. Перенесите надосадочную жидкость в поликарбонатную трубку объемом 10,4 мл и перенесите трубку в ротор 70,1 Ti. Ультрацентрифуга при 100 000 x g в течение 90 минут при 4 °C для гранулирования электромобилей.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы, содержащие EV, в 200 мкл фильтрованного фосфатного буферного раствора (PBS) 0,20 мкм.
2. Изоляция электромобилей
   1. Подготовка отечественной колонки эксклюзионной хроматографии (СЭК)
      1. Опорожните стеклянную хроматографическую колонку (длина: 26 см; диаметр: 0,6 см) (см. Таблицу материалов), вымойте и простерилизуйте ее.
      2. Поместите фильтр 60 μм в нижнюю часть колонки.
      3. Уложите колонну с помощью сшитой фильтрационной матрицы из агарозного геля, чтобы создать неподвижную фазу диаметром 0,6 см и высотой 20 см.
      4. Промойте фазу 50 мл фильтрованного PBS 0,20 мкм. Хранить при температуре 4 °C, чтобы при необходимости использовать позже.
   2. Поместите ресуспендированную гранулу EV на вершину неподвижной фазы колонны SEC.
   3. Соберите 20 последовательных фракций по 250 мкл, продолжая добавлять 0,20 мкм отфильтрованного PBS в верхнюю часть неподвижной фазы, чтобы предотвратить высыхание колонны. При необходимости хранить фракции при температуре -20 °C.
      заметка: Более длительное хранение более чем на одну неделю может быть выполнено при температуре -80 °C для сохранения целостности EV для молекулярного анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среда для культивирования макрофагов и микроглии крыс	Применение ячеек	Р620К-100	Клеточный оргин: нормальный здоровый Rat костный мозг
Первичная микроглия крыс	Лонза	РГ535
Сефароза CL-2B	GE Healthcare	17014001
ультрацентрифуга	Бекман Коултер	А95765
Ротор ультрацентрифуги 70.1 Ti	Бекман Коултер	342184
глюкоза	Сигма-Олдрич	Г8769
Фосфатный буферный раствор	Инвитроген	14190094	Без кальция, без магния
Поликарбонатные центрифужные пробирки	Бекман Коултер	355651
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-122
Экзо-ФБС	Озим	ЭКЗО-ФБС-50А-1	Истощенный экзосомами FBS
DMEM Gibco 41966029
центрифуга	Эппендорф	5804000010
CO2-инкубатор	ТермоФишер
pluriStrainer M/ 60 μм	pluriSelect	43-50060
Колонна MonoP FPLC	GE Healthcare		Больше не доступно