Методическая статья

SDS-PAGE Экстракция белков, ассоциированных с внеклеточными везикулами: процедура извлечения белков из ВВ и подготовки их к перевариванию в геле

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Lemaire, Q. et al. Характеристика внеклеточных везикул, полученных из иммунных клеток, и изучение функционального влияния на клеточную среду. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем метод расщепления в геле SDS-PAGE для извлечения белка из внеклеточных везикул или EV. После выделения полученные фрагменты белка могут быть использованы для протеомного анализа.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Определение характеристик электромобилей

  1. Вестерн-блоттинг
    1. Экстракция белка
      1. Изолируйте EV с помощью колонки эксклюзионной хроматографии (SEC) и количественно оцените с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA).
      2. Смешать 50 мкл буфера RIPA (150 мМ натрия хлорида [NaCl], 50 мМ Триса, 5 мМ этиленгликоля-биса (2-аминоэтилового эфира)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты [EGTA], 2 мМ этилендиамин-тетрауксусной кислоты [ЭДТА], 100 мМ фторида натрия [NaF], 10 мМ пирофосфата натрия, 1% нондета Р-40, 1 мМ фенилметансульфонилфторида [PMSF], 1x ингибитор протеазы) с образцом EV (25 мкл в результате концентрации EV на фильтре) в течение 5 мин на льду до экстракт белков.
      3. Ультразвуковая обработка в течение 5 с (амплитуда: 500 Вт; частота: 20 кГц), 3 раза на льду.
      4. Удалить везикулярный мусор центрифугированием при температуре 20 000 x g в течение 10 мин при температуре 4 °C.
      5. Соберите надосадочную жидкость и измерьте концентрацию белка с помощью метода анализа белка Брэдфорда.
    2. Электрофорез в виде додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинг
      1. Смешайте белковые экстракты (30 мкг) с 5c буфером для образцов Laemmli (v/v).
      2. Загрузите белковую смесь на 12% полиакриламидный гель.
      3. Миграция белков в геле с помощью буфера TGS (25 мМ Tris pH 8,5, 192 мМ глицина и 0,1% SDS) при 70 В в течение 15 мин и 120 В в течение 45 мин.
      4. Перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану с полусухой системой при напряжении 230 В в течение 30 минут.
      5. Пропитайте мембрану в течение 1 ч при РТ блокирующим буфером (0,05% Tween 20 w/v, 5% сухого молока w/v в 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Инкубировать мембрану в течение ночи при 4 °C с мышиным моноклональным антителом к белку теплового шока человека 90 (HSP90), разведенным в блокирующем буфере (1:100).
      7. Промойте мембрану трижды PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) в течение 15 минут.
      8. Инкубировать мембрану в течение 1 ч при РТ с пероксидазой козьего хрена, конъюгированным против мышиного вторичного антитела IgG, разведенным в блокирующем буфере (1:10 000).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контроль проводится с использованием только вторичных антител.
      9. Повторите этап стирки (шаг 1.1.2.7).
      10. Откройте мембрану с усиленной хемилюминесценцией (ECL) вестерн-блоттинг-субстратом (см. Таблицу материалов).

2. Протеомный анализ

  1. Экстракция белка и расщепление в геле
    1. Изолируйте EV с помощью колонки эксклюзионной хроматографии (SEC) и количественно оцените с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA). Повторите шаг 1.1.1 для экстракции белка EV.
    2. Выполните миграцию белка в укладывающем геле 12% полиакриламидного геля.
    3. Закрепите белки в геле синим Кумасси на 20 минут при RT.
    4. Вырежьте каждый цветной кусочек геля и нарежьте его небольшими кусочками по 1 мм3.
    5. Последовательно промойте кусочки геля по 300 мкл каждого раствора: сверхчистой воды в течение 15 мин, 100% ацетонитрила (ACN) в течение 15 мин, 100 мМ бикарбоната аммония (NH4HCO3) в течение 15 мин, ACN: 100 мМ NH4HCO3 (1:1, v/v) в течение 15 мин и 100% ACN в течение 5 мин при непрерывном перемешивании.
    6. Полностью высушите гелевые кусочки с помощью вакуумного концентратора.
    7. Проведите восстановление белка с помощью 100 мкл 100 мМ NH4HCO3, содержащего 10 мМ дитиотреита, в течение 1 ч при 56°C.
    8. Проводят алкилирование белка 100 мкл 100 мМ NH4HCO3, содержащего 50 мМ йодоацетамида, в течение 45 мин в темноте при ЛТ.
    9. Последовательно промойте кусочки геля 300 мкл каждого раствора: 100 мМ NH4HCO3 в течение 15 мин, ACN: 20 мМ NH4HCO3 (1:1, v/v) в течение 15 мин и 100% ACN в течение 5 мин при непрерывном перемешивании.
    10. Полностью высушите кусочки геля с помощью вакуумного концентратора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ацетонитрил Фишер Кемикалс А955-1
Бикарбонат аммония Сигма-Олдрич 9830
Антитела к HSP90 α/β (RRID: AB_675659) Санта-крус СК-13119
Концентрат красителя Bio-Rad Protein Assay (Брэдфорд) Био-Рад 5000006
Дитиотреитол Сигма-Олдрич No 43819
Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота Сигма-Олдрич 03777-10Г
Этилендиаминтетрауксусная кислота Сигма-Олдрич ЭД-100Г
Sonator Fisherbrand Q500 с зондом Фишербранд 12893543
Идоацетамид Сигма-Олдрич И1149
Мгновенное окрашивание белка Blue Coomassie Expedeon ISB1L
Леммли 2x Био-Рад 1610737
Нонидет-40 Флюка No 56741
Пероксидаза AffiniPure Goat AntiMouse IgG (H+L) Иммуноисследования Джексона 115-035-003 (Английский
Конъюгат фаллоидин-тетраметилродаминСанта-крус СК-362065
Ингибитор протеазы Сигма-Олдрич С8830-20ТАБ
Хлорид натрия Шарлау СО0227
Додецилсульфат натрия Сигма-Олдрич Л3771
Фторид натрия Сигма-Олдрич С7920-100Г
Пирофосфат натрия Сигма-Олдрич С6422-100Г
Вакуумный концентратор SpeedVac ТермоФишер
Полусухая передаточная ячейка Trans-Blot SD Био-Рад 1703940
шт. )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи