Имплантация окна для визуализации черепа у мыши: хирургическая процедура по имплантации покровного стекла на основе стекла для стабильного оптического доступа к областям мозга мыши

Аннотация

Источник: Alieva, M. et al. Продольная прижизненная визуализация поведения клеток опухоли головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию.J. Vis. Exp.(2019)

В этом видео представлена хирургическая процедура по имплантации черепного окна в мышиную модель для стабильного оптического доступа к различным областям мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Имплантация опухолевых клеток и подготовка окна визуализации черепа

1. Хирургическая подготовка
   1. Используйте взрослых мышей (>6 недель) любой породы и пола. Успокоить мышь путем введения флуанизона [нейролептика] + фентанила [опиоида]) (0,4 мл/кг) + бензодиазепинового седативного средства (2 мг/кг) в дозе 1:1:2 в стерильной воде. Оцените седативное состояние животного по щипку пальца ноги.
      заметка: В этом протоколе использовались как самки, так и самцы мышей C57BL/6 из-за одного и того же генетического фона опухолевой клеточной линии, используемой в этих экспериментах (GL261). Мышь будет оставаться полностью успокоительной в течение 1,5 часов. В качестве альтернативы можно использовать ингаляционную анестезию, такую как изофлуран (смесь 1,5–2% изофлурана/_О2).
   2. Установите мышь на стереотаксическую рамку и закрепите голову с помощью носового зажима и двух ушных планок.
   3. Используйте нагревательную лампу для поддержания температуры тела. Нагревательную лампу следует использовать с осторожностью, в качестве альтернативы можно использовать водорециркуляционные грелки.
   4. Нанесите глазную мазь, чтобы защитить роговицы мыши от высыхания.
   5. С помощью острых ножниц сбрейте шерсть на черепе (спинная область от глаз мыши до основания черепа) и продезинфицируйте открытые участки кожи 70% этанолом.
   6. Острыми ножницами разрежьте кожу по кругу и соскребите надкостницу под ней ватным тампоном. Нанесите каплю лидокаина 1% + адреналина 1:100 000 на 5 минут и удалите излишки ватным тампоном.
   7. Приклейте края кожи к черепу цианоакрилатным клеем.
   8. Поместите стереотаксическую рамку под диссекционный стереомикроскоп с 4-кратным увеличением.
   9. Визуализируйте череп через микроскоп для вскрытия и просверлите круглую канавку диаметром 5 мм над правой теменной костью. Выполняйте этот шаг осторожно и только поверхностно, избегая любого давления на череп.
   10. Нанесите каплю коркового буфера (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ буфера HEPES, 2 мМ MgSO₄ и 2 мМ CaCl₂ [pH 7,4]) и приподнимите костный лоскут с помощью тонких щипцов.
   11. Для следующих шагов держите поверхность мозга покрытой коровым буфером, если не указано иное.
   12. Под микроскопом вскрытия визуализируйте поверхность мозга и удалите твердую мозговую оболочку с помощью изогнутого, конического, очень тонкого пинцета. Если кровотечение возникает на этой стадии, используйте рассасывающуюся желатиновую губку, чтобы остановить его.

2. Подготовка окна для визуализации черепа

1. Снимите корковый буфер и капните каплю силиконового масла на место трепанации черепа, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха под окном.
2. Запечатайте открытый мозг покровным стеклом толщиной 6 мм. Нанесите цианоакрилатный клей между покровным стеклом и черепом. Аккуратно прижмите покровное стекло к черепу с помощью тонкого пинцета, чтобы обеспечить минимальное расстояние между мозгом и покровным стеклом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Иглы для подкожных инъекций 25G x 16 мм	Микроланс BD
Абсорбируемый желатиновый бисквит	Компания Pfizer	300600
Покровные стекла круглые 6 мм	VWR международный		Гельпенка
Цианоакрилатный клей	Паттекс	631-0168	Гель Pattex Ultra
Стоматологический цемент	Vertex Dental		Вершина самоотверждающаяся
сверло	Dremel		Dremel 3000 (стоматологическая бормашина может быть удобнее) + гравировальная фреза 105
Тонкий изогнутый пинцет	Дюмон
Силиконовое масло	Сигма Олдрич	АГТ508
Стереотаксическая рама	Стоелтинг	181838
Хирургический стереомикроскоп	Олимп		Лабораторный стандартный стереотаксический, крысиный и мышиный
Офтальмологическая мазь	Kela Veterinaria		Duodrops veter kela 10 м
Ксилокаин (Лидокаин 1% + Адреналин 1:100 000) Местный анестетик	Астразенека		Ксилокаин (лидокаин 1% + адреналин 1:100 000)
Гипнорм	ООО «ВетаФарма		Гипнорм (фентанилцитрат 0,315 мг/мл + флуанизон 10 мг/мл)
Мидазолам	Актавис		Мидазолам Актавис 5 мг/мл

»