$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Прижизненная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Временной интервал между введением опухолевой клетки и первым сеансом прижизненной визуализации зависит от типа используемой линии опухолевых клеток. Для экспериментов, показанных в этом протоколе, 1x 105 клеток GL261 были введены и визуализированы через 10 дней.
- Подготовка к визуализации
- Успокоительная мышь с помощью ингаляционной анестезии изофлураном через лицевую маску (смесь 1,5–2% изофлуран/О2).
- Введите мышке подкожно 100 мкл физиологического буфера для предотвращения обезвоживания.
заметка: Для долгосрочной визуализации мышь можно увлажнять с помощью подкожного инфузионного насоса.
- Поместите мышь лицевой стороной вверх в коробку для визуализации. Используйте металлическую пластину с отверстием диаметром 1 мм и небольшими магнитами, встроенными вокруг апертуры, чтобы обеспечить фиксацию CIW к коробке изображения. Введите изофлуран через маску для лица и проветрите через выходное отверстие с другой стороны коробки (смесь 0,8%–1,5% изофлуран/О2). По желанию используйте скотч для фиксации корпуса мыши.
заметка: На этом этапе можно внутривенно вводить флуоресцентно меченный дестран для визуализации кровеносных сосудов или другие красители.
- По желанию используйте пульсоксиметр и нагревательный зонд для контроля жизненно важных показателей мыши.
заметка: В этом эксперименте не было необходимости использовать пульсоксиметр и нагревательный зонд, так как мышь была стабильна на протяжении всего периода визуализации (2–3 ч). Однако для более длительного времени визуализации может потребоваться более тщательный мониторинг.
- Установите 25-кратный водяной объектив (например, HCX IRAPO NA0,95 WD 2,5 мм) в самое нижнее z-положение и добавьте большую каплю воды.
заметка: Использование микродиспенсера с погружением в воду настоятельно рекомендуется для долгосрочных экспериментов, поскольку он позволяет ученым добавлять воду во время эксперимента. В качестве альтернативы можно использовать сухой объектив.
- Перенесите коробку с изображением на микроскоп с темной климатической камерой, температура которой поддерживается при температуре 37 °C. Поднесите объектив к покровному стеклу CIW, пока капля воды не коснется его.
- Используя режим эпифлюоресценции, наблюдайте за опухолью через окуляр и фокусируйте клетки.
2. Получение изображений с помощью интервальной съемки
- Выберите несколько интересующих точек для изображения и запишите их координаты в программу. Убедитесь, что выбранные позиции являются репрезентативными позициями из разных участков опухоли (каждая опухоль может быть разной, но для обеспечения согласованности выберите одинаковое количество позиций, которые являются центральными по отношению к ядру опухоли и по краям у всех мышей).
заметка: Может быть выполнено сканирование части опухоли или всей видимой опухоли; Однако, если опухоль большая, этот метод увеличит интервал между снимками. Кроме того, если опухолевые клетки перемещаются быстро, может быть сложно отследить одни и те же клетки с течением времени.
- Переключитесь в многофотонный режим и настройте лазер на нужную длину волны. Обратите внимание, что во избежание фотоповреждений желательно использовать более высокие длины волн.
заметка: Для получения изображений Dendra2 использовалась длина волны 960 нм. С целью, используемой в этих экспериментах, зума 1,3 было достаточно, чтобы получить хорошее разрешение ядер опухоли и отсканировать репрезентативную область опухоли.
- Перейдем в режим реального времени и определим z-стек для каждой позиции, чтобы получить максимальный объем опухолевых клеток без ущерба для разрешения опухолевых клеток. Определите размер шага между изображениями как 3 мкм.
- Используйте двунаправленный режим для увеличения скорости сканирования. Разрешение изображения должно быть не менее 512 x 512 пикселей.
- Получайте изображения объема опухоли в разных положениях каждые 20 мин в течение 2 ч. Добавляйте воду в объектив перед каждым получением изображения.
заметка: Покадровая съемка может быть получена автоматически, если установить правильную интервальную съемку в программном обеспечении. Однако мышь может двигаться, а позиция или z-стек могут смещаться со временем, что приводит к потере данных. Поэтому рекомендуется выполнять интервальную съемку вручную, а также проверять и корректировать сдвиги xyz между съемками.
- На этом шаге, по желанию, фотопереключите флуоресцентный маркер Dendra2.
заметка: В отличие от покадровой визуализации (которая позволяет изучать свойства отдельных опухолевых клеток и то, как они меняются с течением времени), это позволит изучить зону инфильтрации опухолевых клеток в мозге в течение нескольких дней.