1. Анализ притяжения макрофагов in vitro
- Приготовление кондиционированных сред
- Прогрейте среду для поддержания опухолевых клеток на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 минут.
- Распылите на поверхность вытяжки для культивирования тканей 70% этанола и сотрите 70% этанол с поверхности бумажными полотенцами. Возьмите раствор для отслоения клеток из холодильника. Распылите флаконы со средой и раствором для отслоения клеток 70% этанолом, сотрите 70% этанол с поверхности бумажными полотенцами и занесите их в вытяжку для культуры тканей.
- Выньте из инкубатора 6-луночные планшеты. Тщательно пипетируйте кондиционированную среду в стерильные центрифужные пробирки объемом 15 мл. Положите трубочки на лед. Дозируйте среду в лунку «только среда» в отдельную стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом обязательно проверьте под микроскопом, прикрепляются ли клетки. Если нет, можно использовать пластины с покрытием для лучшего крепления или включить плавающие ячейки в этап подсчета.
- Добавьте 0,5 мл раствора для отделения клеток в каждую лунку 6-луночного планшета. Проверьте, округляются ли опухолевые клетки каждую минуту. Как только опухолевые клетки округляются, осторожно постучите по боковой стороне пластины, чтобы помочь клеткам отделиться.
- Пипеткой нанесите 2,5 мл среды для поддержания опухолевых клеток в лунку, пипетируйте вверх и вниз 3 раза, чтобы перемешать и перенести клетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Возьмите 10 μL клеток и смешайте с 10 μL раствора Trypan Blue. Внесите 10 μл смеси в предметное стекло и количественно определите количество живых клеток с помощью автоматического счетчика клеток.
- Отрегулируйте объем кондиционированной среды в соответствии с количеством клеток, используя среду без сыворотки стволовых клеток (инкубация при температуре 37 °C в течение ночи). Например, если скважина А имеет в 3 раза больше живых клеток, чем скважина с наименьшим числом клеток, разбавьте ее кондиционированную среду в соотношении 1:3. Этот шаг используется для контроля различий, вызванных скоростью пролиферации клеток.
заметка: Причина использования бессывороточной среды для инкубации стволовых клеток при температуре 37 °C в течение ночи заключается в контроле возможного изменения среды при длительном воздействии 37 °C.
- Отфильтруйте кондиционированный фильтрующий материал через фильтры 0,45 мкм. Положите кондиционированный носитель на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются клетки и клеточный мусор в кондиционированной среде.
2. Подготовка ячеек MV-4-11
- Прогрейте среду IMDM (без FBS) на водяной бане 37 °C в течение 20 минут.
- Распылите на поверхность вытяжки для культивирования тканей 70% этанола и сотрите 70% этанол с поверхности бумажными полотенцами. Сбрызните средний флакон 70% этанолом, сотрите 70% этанол с поверхности бумажными полотенцами и занесите их в вытяжку для культуры тканей.
- Поместите колбу с клетками МВ-4-11 в колбу для культуры тканей. Пипетка 10 мл клеток в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Возьмите 10 μл клеток и смешайте с 10 μЛ раствора Трипана Блю. Внесите 10 μл смеси в предметное стекло и количественно определите количество живых клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Промойте клетки 10 мл PBS и центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Ресуспендирование клеток в среде IMDM (без FBS) до конечной плотности клеток 1x106 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество используемых здесь макрофагов можно регулировать.
3. Трансвелловый анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага используйте набор для анализа миграции клеток или приобретите реагенты и вставьте их отдельно. Для ячеек MV-4-11 выбирайте вставки Transwell с размером пор 5 мкм. Чтобы обнаружить миграцию макрофагов, необходимо непосредственно количественно определить количество макрофагов в нижней камере или использовать колориметрические/флуориметрические методы. Здесь мы демонстрируем анализ с использованием колориметрического метода.
- Доведите 24-луночный планшет, вкладыш и реагенты до комнатной температуры.
- Добавьте 250 мкл приготовленных выше элементов MV-4-11 в каждую вставку.
- Добавьте 400 мкл кондиционированной среды/среды (при ночной инкубации при 37 °C эти образцы служат отрицательным контролем) в нижние камеры 24-луночного планшета. Для каждой опухолевой линии или контроля используйте тройные выборки. Избегайте образования пузырей между вкладышем и кондиционированной средой. Пузырьки препятствуют миграции макрофагов в придонные скважины.
- Инкубируйте планшеты в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 4 ч.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации можно регулировать. Клетки, мигрирующие в нижние камеры, можно увидеть под микроскопом.
- Аккуратно постучите вкладышем по внутренней стенке того же колодца и выбросьте вкладыш. Поскольку клетки MV-4-11 растут во взвешенном состоянии, раствор для отслоения клеток или лечение трипсином здесь не требуется.
- Аккуратно пипетируйте клетки в лунках вверх и вниз 3 раза, чтобы перемешать. Перенесите 225 мкл клеточной суспензии на 96-луночный планшет с черными стенками, подходящий для флуоресцентного измерения.
- Разбавьте краситель CyQuant в соотношении 1:75 с 4-кратным буфером для лизиса. Кратковременно похлопайте и раскрутите раствор. Добавьте по 75 мкл раствора в каждую лунку 96-луночного планшета. Выдерживать 15 мин при комнатной температуре.
- Считывание флуоресценции с помощью комплекта фильтров 480/520 нм со считывателем флуоресцентных пластин.
- Анализируйте данные, вычитая бланк и нормализуя до контрольной линии опухолевых клеток.
