Методическая статья

Экстракция внеклеточных везикул: метод выделения внеклеточных везикул из образцов цельных тканей с помощью дифференциального центрифугирования

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Hurwitz, S. N. et al. Извлечение внеклеточных везикул из цельной ткани. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео описывает технику извлечения внеклеточных везикул из свежих или замороженных тканей. Выделенные внеклеточные везикулы могут быть использованы для дальнейшего анализа, чтобы выявить их значимую роль в патогенезе заболевания.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Диссоциация тканей и дифференциальное центрифугирование

  1. Приготовьте 10 мл диссоциативного буфера (10 мг папаина; 5,5 мМ L-цистеина; 67 мкМ 2-меркаптоэтанола; 1,1 мМ ЭДТА) в среде Hibernate-E примерно в 0,4–1,0 г ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые для обогащения и очистки электромобилей, должны быть разбавлены в сверхчистой фильтрованной воде.
  2. Добавьте целую свежую или замороженную ткань в буфер для диссоциации в коническую пробирку объемом 50 мл и инкубируйте на теплой водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 мин. При необходимости ткань можно разрезать на более мелкие фрагменты перед инкубацией.
  3. После инкубации добавьте ингибиторы протеазы и фосфатазы для получения конечной концентрации 1x в буфер диссоциации, содержащий ткань.
  4. Налейте раствор, содержащий ткань, в свободно прилегающий гомогенизатор Dounce и аккуратно диссоциируйте ткань, выполняя примерно 30 медленных движений на образец. Количество ударов может быть скорректировано в зависимости от консистенции тканей.
  5. Диссоциированную ткань в буфере перенесите в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C для гранулирования клеток и оставшихся волокнистых или когезивных фрагментов ткани.
  6. Перелейте надосадочную жидкость в чистую коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при температуре 2 000 x g в течение 10 минут при 4 °C для гранулирования и выбросьте крупный клеточный мусор.
  7. Снова переложите надосадочную жидкость в чистую коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 40 минут при 4 °C для удаления нежелательных крупных везикул или небольших апоптотических тел><. ПРИМЕЧАНИЕ: При желании эту гранулу можно сохранить для дополнительного исследования более крупных везикул.
  8. Сцедите надосадочную жидкость через фильтр 0,45 мкм в чистую ультрацентрифужную пробирку объемом 12 мл.
    заметка: Образцы плотной фиброзной ткани могут быть нелегко отфильтрованы. Эти образцы могут быть отфильтрованы через клеточное сетчатое фильтр толщиной 40 мкм, а затем пропущены через иглы меньшего размера (18 G, 20 G, 22 G) перед фильтром 0,45 мкм.
  9. Ультрацентрифугирование образца при 100 000 x g в течение 2 ч при 4 °C для гранулирования небольших электромобилей.
  10. Сцедите надосадочную жидкость и оставьте ультрацентрифугирующие пробирки перевернутыми на 5–10 минут, часто постукивая, чтобы удалить остатки жидкости с боковых сторон пробирок. Остаточную жидкость также можно отсасывать с помощью аспирационной вакуумной пипетки.
  11. Повторно суспендируйте гранулу EV в 1,5 мл 0,25 М сахарозного буфера (10 мМ Трис, pH 7,4). На этом этапе важно обеспечить полную ресуспендию гранулы. Для этого накройте трубки парапленкой, прежде чем закачивать электромобили в раствор. Покачайте ультрацентрифужные пробирки в течение 15-20 минут при комнатной температуре перед окончательным вихревым перемешиванием.
  12. Кратковременно центрифугируйте пробирки со скоростью не более 1000 x g, чтобы восстановить жидкую суспензию на дне пробирки.
  13. Перейдите к шагам градиентной очистки ниже, или, при необходимости, храните суспензию электромобиля при температуре 4 °C в течение ночи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтр 0,45 мкм ВВРNo 28145-505
Ультрацентрифужные пробирки объемом 12 мл Бекман Коултер331372
Ультрацентрифужные пробирки объемом 5,5 мл Бекман Коултер344057
Ингибитор фосфатазы HALT (100x раствор)ThermoFisher Scientific 78420
Ингибитор протеазы HALT (100x раствор) ThermoFisher ScientificNo 78438
Гибернация E средняяThermoFisher Scientific A1247601
Ротор с качающимся ковшом MLS-50 Бекман Коултер367280 (Английский
Настольная ультрацентрифуга Optima MAX-XP Бекман Коултер393315
)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи