Очистка субпопуляций внеклеточных везикул: методика очистки субпопуляций внеклеточных везикул с помощью ультрацентрифугирования с градиентом плотности

Аннотация

Источник: Urwitz, S. N. et al. Извлечение внеклеточных везикул из цельной ткани. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует метод очистки на основе ультрацентрифугирования градиента плотности для выделения субпопуляций внеклеточных везикул, пригодных для характерных исследований.

Протокол

1. Градиентная очистка плотности

1. Добавьте 1,5 мл 60% йодиксанола (стоковый раствор в воде) в 1,5 мл сахарозы/трис-буфера, содержащего EV, чтобы получить окончательный раствор, содержащий 30% йодиксанола. Проведите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно перемешать раствор.
   заметка: Будьте осторожны, чтобы не потерять раствор в наконечнике пипетки, так как высокая концентрация йодиксанола довольно вязка.
2. Перенесите 30% йодиксаноловый буферный раствор, содержащий EV, на дно ультрацентрифугирующей пробирки объемом 5,5 мл.
3. Приготовьте не менее 1,5 мл 20% и 10% растворов йодиксанола на образец в сверхчистой воде из исходного раствора 60% йодиксанола.
4. Отмерьте 1,3 мл 20% йодиксанола и аккуратно нанесите поверх нижнего градиентного слоя с помощью шприца и иглы 18 G. Чтобы избежать смешивания слоев на границе раздела плотности, держите скос иглы в контакте с внутренней частью ультрацентрифугирующей трубки чуть выше мениска и добавляйте раствор по каплям.
5. Слой 1,2 мл 10% раствора йодиксанола поверх 20% слоя йодиксанола с использованием той же методики, что и выше.
6. Тщательно отбалансируйте и загрузите ультрацентрифужные пробирки в роторные ковши и центрифугуйте в ротор с качающимся ковшом при давлении 268 000 x g в течение 50 мин при 4 °C. Установите скорости ускорения и замедления центрифуги на минимальные значения, допустимые во избежание разрушения слоев плотности.
7. Пометьте десять микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл для каждого образца в соответствии с долями от 1 до 10 градиентов плотности. Фракция 1 обозначается как самая верхняя фракция, которая будет удалена первой, а фракция 10 — это нижняя фракция, которая будет удалена последней.
8. После завершения градиентного ультрацентрифугирования аккуратно извлеките пробирки из ведер ротора и поместите в устойчивый держатель. Видимая полоса везикул часто будет видна в интересующей ее части. Пипеткой нанесите десять последовательных фракций по 490 мкл с вершины градиента в соответствующие пробирки. На дне трубки останется небольшое количество жидкости, которая, вероятно, содержит загрязняющие белки. При желании этот образец можно отбраковать или оставить в качестве фракции 11.
9. Измерьте показатели преломления фракций с помощью рефрактометра. Это также может быть выполнено с помощью параллельного прогона контрольного градиента, если необходимо сохранить образец. Нанесите пипеткой 20–30 мкл каждой фракции, содержащей йодиксанол, на поверхность рефрактометра и оцените плотность, сравнив показатели преломления с известными плотностями йодиксанола.
   заметка: При необходимости фракции могут храниться в течение ночи в растворе, содержащем йодиксанол, прежде чем переходить к следующей стадии промывки ультрацентрифугированием.
10. Переложите каждую фракцию в чистую ультрацентрифужную пробирку объемом 12 мл. Добавьте 5 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KH₂PO₄, pH 7,4) и перемешайте путем медленного пипетирования вверх и вниз><. ПРИМЕЧАНИЕ: PBS, добавляемый в образцы, должен не содержать частиц, что обеспечивается путем фильтрации стерильного PBS через фильтр 0,22 мкм и хранения при комнатной температуре во избежание осаждения солей.
11. Добавьте еще 6 мл 1x PBS доверху и снова тщательно перемешайте.
12. Ультрацентрифугирование пробирок при давлении 100 000 x g в течение 2 ч при 4 °C для повторного гранулирования мелких пузырьков. Сцедите надосадочную жидкость и просточите пробирки перед лизисом везикул для анализа белка или повторной суспензией ВВ для морфологического анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтр 0,45 мкм	ВВР	No 28145-505
Ультрацентрифужные пробирки объемом 12 мл	Бекман Коултер	331372
Ультрацентрифужные пробирки объемом 5,5 мл	Бекман Коултер	344057
Ротор ФА-45-6-30	Эппендорф	5820715006
Ротор с качающимся ковшом MLS-50	Бекман Коултер	367280 (Английский
Настольная ультрацентрифуга Optima MAX-XP	Бекман Коултер	393315
Ультрацентрифуга Optima XE-100	Бекман Коултер	А94516
Оптипреп	сигма	Д1556	60% йодиксанол в стерильном водном растворе
Рефрактометр 30PX (рефрактометр)	Mettler Toledo	51324650
Ротор С-4-104	Эппендорф	5820759003
SW 41 Ti ротор с качающимся ковшом	Бекман Коултер	Номер 333790 (Английский
Настольная центрифуга 5804R	Эппендорф	22623508