Генерация индуцированных нейральных стволовых клеток (iNSCs) из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs): процедура на основе вируса Сендай для перепрограммирования PBMNC в iNSCs

Аннотация

Источник: Zheng, W. et al. Генерация индуцированных нейронных стволовых клеток из периферических мононуклеарных клеток и дифференцировка в сторону предшественников дофаминергических нейронов для исследований трансплантации.J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует перепрограммирование мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNC) в индуцированные нейральные стволовые клетки (iNSCs) с использованием вируса Сендай. Вирус Сендай является неинтегрирующимся вирусом, который представляет собой эффективное и безопасное средство для перепрограммирования клеток.

Протокол

1. Перепрограммирование PBMNC в iNSCs путем заражения SeV

1. Приготовление раствора и питательной среды
   1. Готовят стоковый раствор поли-D-лизина (PDL) путем растворения 100 мг PDL со 100 мл_H2Oдо концентрации 1 мг/мл. Хранить при температуре -20 °C по 1 мл аликвот.
   2. Приготовьте стоковый раствор инсулина, растворив 100 мг инсулина в 20 мл 0,01 Н ГКЛ до концентрации 5 мг/мл. Хранить при температуре -20 °C по 1 мл аликвот.
   3. Для приготовления 200 мл базальной среды iNSC смешайте 96 мл DMEM-F12 и 96 мл основной среды (Таблица материалов) с 2 мл 100-кратного стокового раствора глутамина, 2 мл заменимой аминокислоты (NEAA), 2 мл добавки N2 и 2 мл добавки B27. Добавьте 10 нг/мл рекомбинантного фактора ингибирования лейкемии человека, 3 мкМ CHIR99021 и 2 мкМ SB431542 перед применением. Отфильтруйте среду и храните ее при температуре 4 °C.
      заметка: Используйте средство в течение 2 недель. Добавьте рекомбинантный фактор ингибирования лейкоза человека, CHIR99021 и SB431542 непосредственно перед применением.
2. Перепрограммирование PBMNC в iNSCs путем SeV-инфекции
   1. Ультрафиолетом простерилизуйте чистую скамейку перед использованием. Все поверхности и оборудование стерилизовать 75% спиртом. Простерилизуйте все кончики с помощью автоклава.
   2. В день 0 соберите клетки в среду MNC и перенесите в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 1 мл предварительно подогретой среды МНК.
   3. Посчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипана синего. Ресуспендировать клетки с предварительно нагретой (37 °С) средой MNC до концентрации 2 х 10⁵ клеток на лунку в 24-луночных планшетах.
   4. После извлечения трубок SeV из хранилища при температуре -80 °C разморозьте трубки, содержащие SeV, на водяной бане при температуре 37 °C в течение 5–10 с, а затем дайте им оттаять при RT. После размораживания сразу же положите их на лед.
   5. Добавьте в лунки SeV, кодирующий человеческие Klf4, Oct3/4, SOX2 и c-MyC, при кратности инфекции (MOI) 10. Центрифугируйте ячейки с планшетами при давлении 1 000 x g в течение 30 минут, чтобы облегчить прикрепление ячеек. Оставьте клетки и надосадочную жидкость в пластинах. Поместите пластины в инкубатор при температуре 37 °C, 5% CO₂,
      ВНИМАНИЕ: Все процедуры, связанные с SeV, должны выполняться в безопасном шкафу, а все наконечники и трубки должны быть обработаны этанолом или отбеливателем перед утилизацией.
   6. В день 1 перенесите среду и клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте лунку 1 мл среды MNC. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 500 мкл свежей предварительно подогретой среды MNC в 24-луночных планшетах.
      заметка: Используйте 24-луночный планшет с низким прикреплением, чтобы предотвратить прикрепление любых клеток перед нанесением PDL/ламинина.
   7. На 2-й день разведите 1 мл 1 мг/мл PDL с 19 мл D-PBS до концентрации 50 мкг/мл. Покрыть 6-луночные планшеты 50 мкг/мл PDL не менее чем на 2 ч в режиме ОТ.
   8. Развести 200 мкл 0,5 мг/мл ламинина с 20 мл D-PBS до концентрации 5 мкг/мл. Аспиратируйте PDL в 6-луночных планшетах, и высушите на вертикальном чистом скамейке.
   9. Смажьте 6-луночные планшеты ламинином 5 мкг/мл и инкубируйте в течение 4–6 ч при 37°C. Перед использованием промойте D-PBS.
   10. На 3-е сутки проводят обработку трансдуцированных клеток, полученных на этапе 1.2.6, в среде iNSC на 6-луночных планшетах, покрытых PDL/ламинином.
       заметка: При необходимости осторожно перемещайте пластины после того, как клетки будут помещены на пластины, покрытые PDL/ламинином, стараясь не нарушать прикрепление клеток.
   11. На 5-й день добавьте 1 мл предварительно подогретой (37 °C) среды iNSC в каждую лунку в 6-луночных планшетах осторожно. <бр/> заметка: Ожидается, что клетки подвергнутся резкой гибели (>60%).
   12. На 7-й день добавьте 1 мл предварительно подогретой (37 °C) среды iNSC в каждую лунку в 6-луночных планшетах осторожно.
   13. С 9 по 28 день ежедневно заменяйте отработанную среду свежей предварительно подогретой (37 °C) средой iNSC. Следите за возникновением колоний iNSC. Отбор и перенос клонов iNSC для экспансии занимает примерно 2–3 недели. Соберите колонии с подходящей морфологией с помощью обожженных стеклянных пипеток, исключив любые возможные загрязнители клеток, и аспирируйте колонии с помощью наконечников объемом 200 мкл.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Доплата B27	Инвитроген	17504044
CHIR99021	Генная операция	04-0004 (Английский
ДМЭМ-Ф12	Gibco	No 11330
ДМЭМ-Ф12	Gibco	11320
Ламинин	Рош	11243217001
Доплата N2	Инвитроген	17502048
NEAA	Инвитроген	11140050	Заменимые аминокислоты
Нейробазальный	Gibco	10888 Номер 10888	Базовая среда
ПДЛ	Сигма-Олдрич	П7280	Поли-D-лизин
SB431542	Генная операция	04-0010-10мг	Хранить от света при -20?
Вирус Сендай	Технологии Life	MAN0009378
инсулин	Рош	12585014
24-луночный планшет	Корнинг	No 3337
Коническая трубка 15 мл	Корнинг	430052
6-луночный планшет	Корнинг	No 3516
ЕПВ	Пепротех	100-64-50УГ	Эритропоэтин человека
Фактор ингибирования лейкемии человека	Миллпор	LIF1010
Человеческий рекомбинантный SCF	Пепротех	300-07-100УГ
ИФР-1	Пепротех	100-11-100УГ	Инсулиноподобный фактор роста человека
Ил-3	Пепротех	200-03-10УГ	Интерлейкин человека 3
Дексаметазон	Сигма-Олдрич	Д2915-100МГ
ИМДМ	Gibco	No 215056-023	Модифицированная среда Дульбекко от Искова
инсулин	Рош	12585014
ИТС-Х	Инвитроген	51500-056 (Английский)	Добавка инсулин-трансферрин-селен-X
ГлутаМАКС	Инвитроген	21051024	100 × стоковый раствор глютамина
Ветчина-F12	Gibco	11765-054
1-Тиоглицерин	Сигма-Олдрич	М6145	Токсичен при вдыхании и контакте с кожей
аскорбиновая кислота	Сигма-Олдрич	А92902	Токсичен при попадании на кожу
Замена нокаутирующей сыворотки	Gibco	10828028	Безсывороточная базальная среда
Химически определенный липидный концентрат	Инвитроген	11905031
Трансферрин	Системы НИОКР	2914-ХТ-100Г
Трипан синий	Gibco	Т10282

)