$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными руководящими принципами по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Очистка циркулирующей кДНК из 1 мл плазмы
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется с помощью коммерческого комплекта (см. Таблицу материалов). Все буферы поставляются в комплекте.
- Приготовление буферов и реагентов
осторожность: Не добавляйте кислотные растворы или отбеливатель непосредственно в отходы пробоподготовки. Соли гуанидина, присутствующие в буфере для лизиса, буфере связывания и буфере для промывки-1, в сочетании с отбеливателем или кислотами могут образовывать высокореактивные соединения.
- Буфер для связывания: Смешайте 300 мл концентрата буфера для связывания с 200 мл 100% изопропанола для получения 500 мл рабочего буфера для связывания. Хранить при комнатной температуре.
заметка: Связывающий буфер обеспечивает оптимальное связывание циркулирующих нуклеиновых кислот с мембраной диоксида кремния. 500 мл связывающего буфера достаточно для обработки 276, 138, 92, 69 или 55 образцов 1, 2, 3, 4 или 5 мл плазмы соответственно и стабильно в течение 1 года при комнатной температуре.
- Промывочный буфер-1: Смешайте 19 мл концентрата промывочного буфера-1 с 25 мл 96–100% этанола, чтобы получить 44 мл рабочего промывочного буфера-1. Хранить при комнатной температуре.
заметка: Wash Buffer-1 удаляет загрязнения, связанные с диоксидом кремния. 44 мл рабочего Wash Buffer-1 достаточно для обработки 73 образцов по 1/2/3/4/5 мл плазмы и стабилен в течение 1 года при комнатной температуре.
- Буфер для промывки-2: Хорошо смешайте 13 мл концентрата Буфера для промывки-2 с 30 мл 96–100% этанола, чтобы получить 43 мл рабочего буфера для промывки-2. Хранить при комнатной температуре.
заметка: Wash Buffer-2 устраняет загрязнения, связанные с диоксидом кремния. 43 мл рабочего Wash Buffer-2 достаточно для обработки ~56 образцов 1/2/3/4/5 мл плазмы и стабилен в течение 1 года при комнатной температуре.
- В пробирку, содержащую 310 мкг лиофилизированной РНК-носителя, добавляют 1550 мкл элюирующего буфера, чтобы получить раствор несущей РНК в концентрации 0,2 мкг/мкл. После тщательного растворения несущей РНК разделите раствор на подходящие аликвоты и храните при температуре от -30 °C до -15 °C. Не замораживайте-размораживайте эти аликвоты более 3 раз. В буфер для лизиса, как показано в таблице 1, добавьте восстановленную РНК-носитель, растворенную в буфере для элюирования.
заметка: Поскольку РНК-носитель не растворяется непосредственно в буфере для лизиса, она должна быть растворена сначала в буфере для элюирования, а затем в буфере для лизиса. Во-первых, связывание диоксидной мембраны с нуклеиновой кислотой усиливается, когда в образце присутствует очень мало целевых молекул. Во-вторых, снижается риск деградации РНК из-за наличия большого количества РНК-носителей.
- Перед началом выделения доведите колонки и образцы до комнатной температуры и при необходимости отрегулируйте объем образцов до 1 мл с помощью стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Разогрейте 2 водяные бани или нагревательные блоки, содержащие центрифужные пробирки объемом 50 мл и 2 мл сборные пробирки, до 60 °C и 56 °C соответственно.
- В центрифужную пробирку объемом 50 мл добавьте 100 мкл протеиназы К, 1 мл плазмы и 0,8 мл буфера для лизиса, содержащего 1,0 мкг РНК-носителя (приготовленного на шаге 1.1.4). Закройте пробирку центрифуги крышкой и перемешайте содержимое путем импульсно-вихревой обработки в течение 30 с, обеспечивая при этом видимый вихрь в пробирке. Тщательное перемешивание содержимого имеет важное значение для эффективного лизиса.
заметка: Сразу после вортекса приступайте к шагу 1.4, не откладывая.
- Инкубировать раствор при температуре 60 °C в течение 30 минут.
- Снимите колпачок, добавьте в пробирку 1,8 мл связующего буфера и тщательно перемешайте с импульсным вихревом в течение 15–30 с после установки колпачка.
- Полученную смесь инкубировать в течение 5 мин на льду и вставить колонну с силикатной мембраной в вакуумный аппарат, который подключен к вакуумному насосу. Затем плотно вставьте удлинитель пробирки объемом 20 мл в открытую колонку, чтобы предотвратить утечку пробы.
- Осторожно вылейте инкубированную смесь в трубку удлинителя колонки и включите вакуумный насос. После того как вся смесь лизата полностью пройдет через колонны, выключите вакуумный насос, сбросьте давление до 0 мбар, а также снимите и выбросьте удлинитель трубки><.
заметка: Во избежание перекрестного загрязнения удлинитель пробирки следует осторожно выбросить, чтобы предотвратить его распространение на соседние колонны.
- Извлеките колонку из вакуумного аппарата, вставьте в сборную пробирку и центрифугируйте при давлении 11 000 x g в течение 30 с при комнатной температуре, чтобы удалить остатки лизата. Откажитесь от проточного потока.
- Добавьте в колонку 600 μL Wash Buffer-1, центрифугируйте при 11 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре, выбросьте проточный.
- Добавьте в колонку 750 μL Wash Buffer-2, центрифугируйте при 11 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре и выбросьте проточный.
- Добавьте в колонку 750 μл этанола (96–100%), центрифугируйте при 11 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре и выбросьте проточный.
- Центрифугируйте колонку при давлении 20 000 x g в течение 3 минут, поместив ее в чистую пробирку для сбора объемом 2 мл.
- Полностью высушите узел мембранной колонны, поместив его в новую сборную пробирку объемом 2 мл с открытой крышкой и инкубируя при температуре 56 °C в течение 10 минут.
- Поместите колонку в чистую пробирку для элюирования объемом 1,5 мл. На центр мембраны колонки нанести 20–150 мкл элюирующего буфера и инкубировать при комнатной температуре в течение 3 мин при закрытой крышке.
заметка: Убедитесь, что буфер для элюирования сбалансирован до комнатной температуры. В случае использования элюирующего буфера менее 50 μл убедитесь, что он аккуратно дозирован на центр мембраны. Это помогает с полным элюированием связанной ДНК. Тем не менее, объем элюирования не является фиксированным и может быть изменен в соответствии с последующими приложениями. Восстановленный элюат может составлять до 5 мкл и заведомо меньше объема элюирования, нанесенного на колонку.
- Восстановленный элюат центрифугируют в микроцентрифуге при давлении 20 000 x g в течение 1 мин для элюирования нуклеиновых кислот и хранят при температуре -20 °C.
См.
См.
См.
См.
балла
См.
См.
См.
мм
См.
См.
См.
См.
мм
мм
См.
См.
См.
См.
См.
мм
См.
мм
См.
мм
См.
См.
см.
См.
мм
мм
См.
См.
мм
См.
См.
См.
| Номер образца | Буфер для лизиса (мл) | РНК-носитель в буфере для элюирования (μL) |
| 1 | 0,9 | 5.6 |
| 2 | 1.8 | 11.3 |
| 3 | 2.6 | 16,9 |
| 4 | 3.5 | 22,5 |
| 5 | 4.4 | 28,1 |
| 6 | 5.3 | 33,8 |
| 7 | 6.2 | 39,4 |
| 8 | 7 | 45 |
| 9 | 7,9 | 50,6 |
| 10 | 8,8 | 56,3 |
| 11 | 9,7 | 61,9 |
| 12 | 10,6 | Серия 67,5 |
| 13 | 11.4 | 73,1 |
| 14 | 12.3 | 78,8 |
| 15 | 13.2 | 84,4 |
| 16 | 14,1 | 90 |
| 17 | 15 | 95,6 |
| 18 | 15,8 | 101.3 |
| 19 | 16,7 | 106,9 |
| 20 | 17.6 | 112,5 |
| 21 | 18,5 | 118,1 |
| 22 | 19,4 | 123,8 |
| 23 | 20.2 | 129,4 |
| 24 | 21.1 | 135 |
Таблица 1. Объемы лизисного буфера и несущей РНК (растворенной в элюирующем буфере), необходимые для обработки образцов плазмы объемом 1 мл.