Автоматизированный анализ распределения фрагментов cfDNA по размерам на основе капиллярного электрофореза: метод изучения распределения фрагментов ДНК по размерам фрагментов ДНК, выделенных из биожидкостей на основе капиллярного электрофореза: метод изучения распределения по размерам фрагментов ДНК, выделенных из биожидкостей на основе микрочипов ДНК

Аннотация

Источник: Palande, V. et al. Обнаружение внеклеточной ДНК в образцах плазмы крови онкологических больных. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы анализируем распределение по размерам внеклеточной ДНК или фрагментов cfDNA с помощью автоматического капиллярного электрофореза. Этот метод помогает получить представление о профиле фрагментов ДНК, выделяемых раковыми клетками во время апоптоза.

Протокол

1. Распределение фрагментов ДНК по размерам cfDNA с помощью анализатора фрагментов

1. Шаг перед началом процедуры: Уравновесьте концентрат ДНК-красителя и матрицу ДНК-геля до комнатной температуры в течение 30 минут.
2. Приготовление смеси гель<-краситель /> заметка: Обращайтесь с растворами с осторожностью, так как известно, что ДМСО способствует проникновению органических молекул в ткани.
   1. Тщательно разморозьте ДМСО, вортексируя флакон с концентратом ДНК-красителя в течение 10 с. Пипеткой выведите 15 мкл этого концентрата во флакон с гелевой матрицей ДНК и храните при температуре 4 °C в темноте.
   2. Снова переведите закупоренный флакон на 10 с, пока не будет визуализировано смешивание геля и красителя.
   3. Вылейте смесь на спин-фильтре в верхнюю емкость.
   4. Микроцентрифугу спинового фильтра при давлении 2 240 x g ± 20% в течение 10 мин при комнатной температуре.
   5. Нанесите маркировку на приготовленный гель-краситель в пробирку и выбросьте фильтр в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Наклейте на пробирку этикетку и запишите дату приготовления.
      заметка: Выбросьте фильтрат в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Смесь гелей и красителей может быть использована для 5 высокочувствительных (HS) ДНК-чипов. При отсутствии использования более 1 часа хранить при температуре 4 °C. Хранение в темноте возможно до 6 недель.
3. Для загрузки гелево-красящей смеси необходимо обеспечить положение опорной плиты станции грунтовки стружки и отрегулировать клипсу в самом низком положении.
   1. Уравновесьте смесь геля и красителя до комнатной температуры в течение 30 минут, контролируя при этом воздействие света.
   2. Возьмите новый чип HS DNA из герметичного пакета и поместите его на станцию грунтовки чипов, затем удалите 9,0 мкл смеси геля и красителя и распределите его на дно ячейки чипа, обозначенной как 'G'.
      заметка: Составьте смесь геля и красителя, избегая частиц, которые могут скапливаться на дне флакона. При дозировании гелево-красящей смеси в чип HS DNA полностью вставьте кончик пипетки, чтобы предотвратить образование крупных пузырьков воздуха. Более того, прикосновение к пипетке по краям лунки приведет к плохим результатам.
   3. Установите поршень на 1 мл и закройте станцию грунтовки стружки. Убедитесь в щелчке фиксатора защелки и установите таймер на 60 с, затем нажмите на поршень до упора в зажим, а ровно через 60 с отпустите поршень с помощью механизма разблокировки клипсы.
   4. Когда поршень отступит по крайней мере до отметки 0,3 мл, подождите 5 с, а затем медленно вернитесь в положение 1 мл, затем откройте станцию грунтовки чипа и снова удалите 9,0 мкл смеси геля и красителя и распределите на дно ячейки чипа HS DNA, обозначенной буквой «G».
4. Чтобы загрузить ДНК-маркер, нанесите 5 мкл ДНК-маркера в лунку, отмеченную символом лестницы. Повторите процедуру для всех 11 лунок для отбора проб.
5. Чтобы загрузить лестницу и образцы, выдайте 1 мкл трапа ДНК в лунку, отмеченную символом лестницы, а затем добавьте 1 мкл образца (использованные лунки) или 1 л маркера (неиспользованные лунки) во все 11 лунок для образцов.
6. Сделайте вихревой настройку чипа HS DNA на 60 с со скоростью 2 400 об/мин, поместив чип горизонтально в адаптер. Убедитесь, что выпуклость, фиксирующая чип HS DNA, не повреждена во время вортексинга.
7. Чтобы вставить чип HS DNA в прибор для анализа фрагментов, откройте крышку и убедитесь, что картридж с электродом вставлен правильно, а селектор чипа расположен в положении «dsHigh Sensitivity DNA» в приборе для анализа фрагментов.
8. Осторожно установите чип HS DNA в розетку, которая подходит только в одном направлении, затем закройте крышку, убедившись, что картридж с электродом точно входит в лунки чипа HS DNA.
9. На экране программного обеспечения анализатора фрагментов отображается вставленный чип HS DNA и закрытая крышка через значок чипа в верхней левой части экрана.
10. Чтобы начать прогон чипа HS DNA, выберите высокочувствительный анализ dsDNA в меню «Анализ» на экране прибора, затем правильно заполните таблицу названий образцов, введя такую информацию, как названия образцов и комментарии, и запустите прогон чипа, нажав кнопку «Старт» в правом верхнем углу экрана.
11. Очистка электродов после прогона чипа HS DNA: Немедленно извлеките использованный чип HS DNA сразу после завершения анализа и утилизируйте его в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Выполните следующую процедуру, чтобы убедиться, что электроды чистые, без остатков предыдущего анализа.
    1. Медленно налейте 350 мкл деионизированной воды в одну из лунок для очистки электродов и поместите очиститель электродов в прибор для анализа фрагментов, открыв крышку, а затем закройте крышку и подождите около 10 секунд.
    2. Снимите очиститель электродов, открыв крышку, и подождите еще 10 секунд, пока вода на электродах испарится, прежде чем закрывать крышку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биоанализатор 2100	Компания Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	Биоанализатор 2100 представляет собой признанный автоматизированный инструмент электрофореза для контроля качества биомолекул в пробах.
Регулируемый зажим для станции грунтовки	Компания Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Используется в сочетании со шприцем для приложения заданного давления для грунтовки стружки.
Пробирки с консервантами cf-DNA/cf-RNA	Корпорация «Норген Биотек»	No 63950 (Английский	Пробирки-консерванты cf-DNA/cf-РНК Norgen представляют собой закрытые вакуумные пластиковые пробирки для сбора и сохранения cf-ДНК, циркулирующей опухолевой ДНК, cf-РНК и циркулирующих опухолевых клеток в образцах цельной крови человека во время хранения и транспортировки
Станция грунтовки стружки	Компания Agilent Technologies, Inc.	5065-4401 (Английский)	Используется для загрузки гелевой матрицы в чип с помощью шприца, прилагаемого к каждому набору для анализов, используется для анализа РНК, ДНК и белков. Включает в себя станцию для прайминга, секундомер и 1 зажим для шприца
Комплект для чистки электродов	Компания Agilent Technologies, Inc.	5065-9951 (Английский)	Предотвращает перекрестное загрязнение. Удаляет бактериальные или белковые загрязнения с электродов.
Фильтры для гелевой матрицы	Компания Agilent Technologies, Inc.	Тел.: 185-5990	Используется для правильного смешивания концентрата красителя ДНК и матрицы геля ДНК
Вихревой чип IKA Basic	IKA-Werke GmbH & Co. KG	МС-3-С36	Используется для правильного смешивания лестницы ДНК и образца ДНК на чипах биоанализатора
Центрифужные пробирки 50 мл
Этанол (96–100%)
Нагревательный блок или аналогичный при 56 °C (способен удерживать сборные пробирки объемом 2 мл)
Фосфатно-солевой буфер (PBS)
Пипетки (регулируемые)
Стерильные наконечники для пипеток (рекомендуется использовать наконечники для пипеток с аэрозольными барьерами для предотвращения перекрестного загрязнения)
Водяная баня или нагревательный блок, способный вместить центрифужные пробирки объемом 50 мл при температуре 60 °C

гг. )