Капельная цифровая полимеразная цепная реакция: метод генерации нанокапельных ПЦР-реакций для выявления редких опухолевых мутаций

Аннотация

Источник: Боннер, Э. Р. и др. Обнаружение и мониторинг циркулирующей ДНК, связанной с опухолью, в биожидкостях пациентов. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы представляем пошаговую процедуру создания эмульгированных нанокапель для обнаружения целевых нуклеиновых кислот с помощью цифровой полимеразной цепной реакции или dPCR.

Протокол

1. Обнаружение и количественное определение целевой ДНК с помощью dPCR

1. Приготовьте реакционную смесь для дПЦР для 8 лунок полосковой пробирки для ПЦР плюс 10% дополнительно, добавив 220 мкл мастер-смеси для генотипирования, по 8,8 мкл 10 мкМ зондов дикого типа и мутантных зондов, по 39,6 мкл 10 мкМ прямых и обратных праймеров и 17,6 мкл масла, стабилизирующего капли.
2. Аккуратно перемешайте реакционную смесь для дПЦР, пипетируя весь объем вверх и вниз 10–20 раз. Не проводите вихревую обработку или центрифугирование после того, как в реакционную смесь было добавлено стабилизирующее капли масло.
3. Возьмите 8-луночную полосковую пробирку для ПЦР и выдайте 38 мкл реакционной смеси dPCR непосредственно на дно каждой лунки. Удалите все пузырьки чистым наконечником для дозатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стрип-пробирки для ПЦР, которые сцеплены или плотно упакованы друг к другу, могут привести к образованию статических электрических зарядов, вызывая коалесценцию и зашумленный сигнал при анализе данных dPCR. Чтобы избежать этого, разделите пробирки на отдельные пакеты для биологически опасных веществ, избегайте чрезмерной упаковки пакетов и не допускайте трения пробирок друг о друга.
4. Добавьте 12 мкл предварительно амплифицированного образца ДНК в соответствующие лунки ПЦР-полосковой пробирки. Для отрицательного контроля добавьте 12 μL MB H₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируйте образцы cfDNA в реплицируемых лунках. Для ликвора анализируйте по крайней мере в двух экземплярах, а для плазмы/сыворотки анализируйте каждый образец в трех экземплярах.
5. Аккуратно пипетируйте весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать реакционную смесь с образцом ДНК.
6. Получить новый чип для генератора капель и дозировать весь объем из лунок 1–8 полосковой пробирки ПЦР в соответствующие каналы A–H в чипе. Избегайте прикосновения наконечником пипетки к нижней части каналов.
7. Возьмите новую чистую полосковую пробирку для ПЦР и вставьте ее в каплеобразующий инструмент. Отсканируйте или вручную введите идентификатор чипа прибора, генерирующего капли, в программное обеспечение на компьютере прибора. Введите названия для каждого из 8 каналов. Нажмите кнопку Начать прогон, чтобы начать дроплетовку образцов.
8. Когда каплетка завершится, извлеките пробирку с полоской ПЦР и наложите колпачки на полосковые пробирки.
9. Перенесите полосковую трубку в термоамплификатор и уравновесьте другой полосовой трубкой, содержащей 80 μл воды на лунку.
10. Запрограммируйте условия термоциклирования следующим образом: 95 °C в течение 10 минут; 45 циклов двух температур: 95 °C в течение 30 с и температура отжига в течение 2 минут; 98 °C в течение 10 минут; и держите при 10 °C.
    1. Установите скорость линейного изменения на 0,5 °C/с и объем образца на 80 μл.
11. Когда термоциклирование будет завершено, снимите полосковую трубку и передайте ее в прибор для количественного анализа. Снимите колпачки с полосками ПЦР и замените их на высокоскоростные колпачки.
12. Включите прибор для количественного анализа и подключенный компьютер с программным обеспечением прибора. Запустите программное обеспечение прибора и нажмите кнопку Настроить прогон.
13. Поместите полосковую трубку в прибор для количественного определения.
14. Приобретите новый чип прибора для количественного анализа и отсканируйте или вручную введите идентификатор чипа в прибор. Вставьте чип в машину.
15. Поместите металлический щиток поверх чипа и закройте крышку прибора.
16. В компьютерном программном обеспечении введите название для запуска dPCR и для каждого из 8 каналов (A–H). Выберите Быстрый режим (который необходимо использовать с высокоскоростными ограничениями) и нажмите Пуск, чтобы начать количественную оценку.
17. Когда количественное определение будет завершено, снимите металлический экран (для сохранения и повторного использования) и утилизируйте пробирку и чип для ПЦР-стрип. На компьютере прибора журнал прогона будет содержать файлы результатов для каждого прогона. Используйте файлы .fcs для каждой выборки для анализа с помощью аналитического программного обеспечения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор расходуемых материалов Raindance	Био-Рад	20-04411 (Английский	Содержит микросхемы для приборов, генерирующие капли, микросхемы для количественного анализа, стрип-колпачки для ПЦР, включая высокоскоростные колпачки, и масло, стабилизирующее капли
Инструмент Raindance Sense	Био-Рад		Прибор для количественного определения
Инструмент Raindance Source	Био-Рад		Инструмент для генерации капель
Программное обеспечение RainDrop Analyst II	Технологии RainDance		Аналитическое программное обеспечение, используемое для анализа данных
Термомиксер C	Эппендорф	14 285 562PM
Термоамплификатор MiniAmp	Thermofisher Scientific	А37834
Крышки для пробирок PCR на 8 лунок	ВВР	10011-786
Полосковые пробирки для ПЦР на 8 лунок	Аксиген	ПЦР-0208-С
Q5 Hot Start Высококачественный мастер-микс 2x	Новая Англия Биолабс Инк	М0494С

)