MSC Seeded Scaffold Preparation: Методика подготовки каркаса, засеянного мезенхимальными стволовыми клетками, для хирургической имплантации в мышиную модель

Аннотация

Источник: Sheets, K. T. et al. Резекция глиобластомы под визуальным контролем и внутричерепная имплантация терапевтических каркасов, засеянных стволовыми клетками. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео описывает технику посева мезенхимальных стволовых клеток (МСК) на биоразлагаемый поли(молочнокислый) (PLA) каркас. Подготовленные каркасы могут быть имплантированы в операционную резекционную полость головного мозга, откуда они могут мигрировать в сторону опухолевых очагов. Кроме того, эти клетки могут быть сконструированы для экспрессии терапевтических белков для стимуляции апоптоза в раковых клетках.

Протокол

1. Клеточная культура и подготовка каркаса

ПРИМЕЧАНИЕ: Скаффолды должны быть подготовлены за 48 часов до имплантации мышам. Следующие объемы приведены по каждому каркасу. Умножьте количество по мере необходимости для дополнительных каркасов.

1. Разрежьте поли(молочнокислотные) (PLA) каркасы на части размером с резекционную полость (примерно 2 мм x 2 мм). Леса можно резать вручную с помощью ножниц или с помощью дырокола для повторяемости.
2. Стерилизовать путем погружения в 70% этанол на 15 минут с последующим погружением в PBS. Поместите каркас в модифицированную среду Дульбекко (DMEM), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина, во время подготовки клеток к посеву.
3. Поднимите культивируемые МСК с использованием 0,05% трипсина (3–5 мл для колбы T75). Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут. Убедитесь, что клетки поднялись, затем добавьте в колбу 7–10 мл DMEM для инактивации трипсина.
4. Переложите содержимое колбы в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Гранулы 5 x 10⁵ MSC для каждого каркаса путем центрифугирования при 100 x g в течение 5 минут.
5. Отбирать надосадочную жидкость и ресуспендировать МСК в дозе 5 л DMEM на 5 x 10⁵ клеток.
6. Подготовьте леса к посеву, промокнув их насухо.
   1. Снимите скаффолд с погружения DMEM с помощью щипцов и временно поместите его на крышку 6-луночной пластины. Снимите каркас с крышки, оставив после себя каплю излишков DMEM.
   2. Снова положите строительные леса на крышку в новое, сухое место. Повторите 3–5 раз, затем поместите частично высохший каркас в новую 6-луночную пластину для посева. Повторите для каждого леса.
      заметка: Частично высушенный каркас обеспечивает оптимальные результаты посева ячеек. Если каркас слишком влажный, клетки будут соскальзывать с каркаса и прилипать к расположенной ниже пластине колодца. Если каркас слишком сухой, капля не будет распространяться по всему каркасу, что приведет к плохому первоначальному распределению клеток.
7. С помощью пипетки аккуратно перемешайте флакон со стволовыми клетками, чтобы гомогенизировать суспензию, так как некоторые клетки могли осесть на дно.
8. Медленно нанесите пипеткой 2,5 мкл свежеперемешанной суспензии MSC непосредственно на каркас, создавая небольшую каплю над верхней частью каркаса.
9. Добавьте по 300 мкл DMEM на края каждой лунки. Это предотвратит быстрое испарение клеточной капли. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, давая клеткам прикрепиться к каркасу.
10. С помощью щипцов аккуратно переверните скаффолды в лунной пластине. Семян 2,5 мкл свежесмешанной суспензии МСК (в результате получается всего 5 х 10^{5 клеток} на один скаффолд). Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, давая клеткам прикрепиться к каркасу.
11. Накройте скаффолды DMEM, добавив по 2 мл в каждую лунку 6-луночного планшета. Осторожно поднимите подмостки, чтобы под ними мог течь фильтрующий материал. Инкубировать при 37 °C в этом состоянии в течение 48 ч до операции по имплантации.
12. Проверьте каркасы через 24 часа и добавляйте/меняйте материал, если наблюдается избыточное испарение или обесцвечивание материала из-за дисбаланса pH.