Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Флуоресцентная резекция и имплантация скаффолда
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все инструменты перед началом операции.
- Поместите стереотаксическую рамку на предметный столик флуоресцентного препарирующего стереомикроскопа.
- Обезболите мышь под действием ингаляционного изофлурана в индукционной камере. После обезболивания закрепите мышь в стереотаксической раме с непрерывной подачей ингаляционной анестезии через адаптер носового конуса изофлурана. Поддерживайте температуру тела с помощью грелки и/или зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: 4–5% изофлуран подходит для индукции, а 2–3% — для поддержания, но это должно быть адаптировано и контролироваться для каждой мыши.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Простерилизуйте место разреза кожи головы серией из трех спиртовых и трех бетадиновых салфеток.
- Проведите тест на щипковый рефлекс на каждой конечности и подтвердите отрицательную реакцию, чтобы обеспечить надлежащую анестезию. Обеспечьте устойчивую частоту дыхания на уровне примерно 55–65 вдохов/мин.
- С помощью щипцов ущипните и аккуратно приподнимите кожу головы. Хирургическими ножницами сделайте средний линейный рострально-каудальный разрез. Орошите место разреза PBS и удалите подкожный жир с помощью аппликатора с ватным наконечником круговыми движениями щеткой. Расположите кожу таким образом, чтобы ранее установленное черепное окно было полностью видно.
- Аккуратно проколите твердую мозговую оболочку внутри до границ черепного окна с помощью иглы 18G. Повторяйте до тех пор, пока надрез полностью не протянет внутреннюю часть окна.
- Удалите твердую мозговую оболочку, отклеив ее тонкими щипцами, обнажив лежащую под ним паренхиму и опухоль.
- Чтобы найти опухоль U87 mCh-Fl, выключите освещение в комнате и включите флуоресцентный режим стереомикроскопа. Подготовьтесь к резекции, загрузив наконечник пипетки объемом от 1 до 200 мкл в конец трубки вакуумного насоса.
- Включите вакуумный насос. Резецируйте опухоль путем осторожной аспирации флуоресцентной ткани до тех пор, пока сигнал не исчезнет. Выключите вакуумный насос и выбросьте наконечник для дозатора. Выключите флуоресцентную лампу и снова включите свет в комнате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы остановить кровотечение, орошайте холодным PBS и постоянно надавливайте аппликатором с ватным наконечником. В более тяжелых случаях резекционная полость также может быть временно тампонована кровоостанавливающим средством, при условии, что оно удаляется после остановки кровотечения с последующим еще одним орошением PBS.
- Непосредственно перед имплантацией медленно окуните засеянный MSC каркас PLA в PBS для удаления нежелательных сред и связанных с ними компонентов. Имплантируйте каркас в резекционную полость. При необходимости добавьте 1 мкл фибриногена (67–106 мг/мл), а затем 1 мкл тромбина (400–625 Ед/мл), чтобы закрепить каркас на месте.
- Когда твердая мозговая оболочка удалена, а костный лоскут из черепного окна уже отброшен, запечатайте рану, просто закрыв кожу и нанеся хирургический клей. Извлеките животное из ингаляционного анестетика и дайте восстановиться на нагретой поверхности.
