Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Мечение клеток глиобластомы с помощью конструкции FP635 или FP720
- Производят и очищают лентивирус в соответствии с протоколом, описанным ниже:
- Понаблюдайте за блюдами, посеянными в 1-й день. Когда клетки на 80–90% сливаются, они готовы к трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки все еще должны иметь место для 1–2 делений
- Приготовьте плазмидную смесь, аликвотировав четыре плазмиды в пробирку объемом 50 мл. Для приготовления блюда размером 12 × 15 см используйте 270 мкг вектора переноса, 176 мкг pMDL (Gag/Pol), 95 мкг pVSVG (гликопротеин вируса везикулярного стоматита) и 68 мкг pREV.
- Приготовьте 13,5 мл 0,25М CaCl2 (разбавьте фильтрованным ddH2O) и добавьте в плазмидную смесь. Добавьте 13,5 мл 2× раствора BBS. Аккуратно перемешайте, перевернув несколько раз, и выдерживайте 15 минут при комнатной температуре (22–26°).
- Добавьте трансфекционную смесь (распределяя по каплям) на каждую пластину (2,25 мл на тарелку). Осторожно перемешайте планшеты и инкубируйте при 3%CO2, 37 °C в течение ночи (16–20 часов).
- Понаблюдайте за клетками. Они должны достигать слияния. Если в лентивекторной плазмиде присутствует видимый маркер (например, GFP), эффективность трансфекции может быть оценена визуально. В идеале эффективность трансфекции должна составлять >90%.
- Удалите среду, добавьте 15 мл свежего DMEM + 2% FBS в каждую посуду и переведите до 10% CO2, 37 °C. Выдерживайте в течение ночи.
- Соберите первый урожай надосадочной жидкости: Соберите и объедините надосадочную жидкость (12 посуды × 15 мл/чашка = 180 мл) из посуды.
- Добавьте в каждое блюдо по 15 мл свежего DMEM + 2% FBS. Инкубируйте чашки при 10% CO2, 37 °C в течение ночи. Сосуд, содержащий надосадочную жидкость лентивируса, следует поместить во вторичную защитную оболочку (подойдет герметичный пластиковый пакет) и хранить при температуре 4 °C.
- Концентрируйте вирусный препарат: Концентрируйте вирусные частицы с помощью ультрацентрифугирования. Центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 70 000 x g в течение 2 ч при 20 °C. Рекомендуется использовать конические пробирки (в отличие от трубок с круглым дном) и роторы с качающимся ковшом (в отличие от роторов с фиксированным углом) (просто потому, что такая комбинация облегчает обнаружение почти невидимой гранулы). Мы используем конические пробирки с ротором Beckman SW28 (емкость для шести пробирок) при 19 400 об/мин в течение 2 ч при 20 °C. Заполните пробирки 30 мл надосадочной жидкости. Общий объем надосадочной жидкости из приготовления блюда размером 12 × 15 см составляет 360 мл; Поэтому для обработки полного объема потребуется два последовательных вращения. Загрузите трубки, сделайте первый отжим, вылейте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, перезагрузите свежий вирусный надосадочный слой и проведите второй отжим.
- Слейте надосадочную жидкость и дайте оставшейся жидкости стечь, положив перевернутые трубки на бумажные полотенца. Откачайте оставшиеся капли с помощью аспиратора для того, чтобы удалить всю жидкость из гранулы. Гранула должна быть едва заметна в виде небольшого полупрозрачного пятна.
- Ресуспендируйте вирусные гранулы в 100 мкл 1× HBSS. Избегайте вспенивания. Промойте пробирки 100 μл 1× HBSS. Объедините оба объема для получения конечного объема 200 μL.
- Переложите в микропробирку с завинчивающейся крышкой, оберните парапленкой и вдохните на низкой скорости в течение 15–30 минут. Ресуспендированный вирусный препарат будет выглядеть от прозрачного до слегка молочного.
- Очистите суспензию путем вращения в течение 10 с на настольной микроцентрифуге. Перенесите надосадочную жидкость в свежую микрофужную пробирку с завинчивающейся крышкой. Внесите 20 мкл аликвоты надосадочной жидкости. Этот вирусный надосадочная жидкость имеет качество in vitro.
- Культивируйте приблизительно 2,0 x 106 клеток из клеточной линии глиомы человека с DMEM плюс 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в чашке размером 15 см; или культивируйте 2,0 x 106 сфер пациента с глиобластомой человека (GBM-PDX) средой DMEM/F12 1:1 с добавкой B27 плюс человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор роста (EGF; 20 нг/мл) и FGF (10 нг/мл) в колбе T75.
- Поддерживайте во всех клетках температуру 37 °C, 5%CO2 и относительную влажность 100%.
- Диссоциируйте клетки.
- Для клеток глиомы: удалить надосадочную жидкость из пластин и добавить в клетки глиомы 3-5 мл трипсина 1Х.
- Для сфер GBM: соберите клетки путем пипетирования клеток в пробирку объемом 15 мл.
- Вращайте сферы GBM при давлении 200 x g в течение 5 минут с помощью настольной центрифуги при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную жидкость и добавьте 3–5 мл раствора для отслоения клеток.
- Инкубируйте все клетки при температуре 37 °C в течение 10–15 минут.
- Осторожно диссоциируйте клетки, пипетируя вверх и вниз несколько раз (убедитесь, что сферы и клетки глиомы полностью диссоциированы) и вращайте вниз при 200 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки 5 мл среды, проводя пипетирование вверх и вниз несколько раз. Определяют жизнеспособность клеток с помощью исключения трипанового синего.
- Планшет 1,0 х 106 клеток-мишеней в чашке 10 см с 5 мл среды путем пипетирования.
- Трансдуцировать клетки лентивирусом, экспрессирующими флуоресцентные белки при кратности инфекции (MOI) 5, и инкубировать при 37 °C.
- Через 24 ч удалите среду из трансдуцированных клеток, добавьте 5 мл свежей среды и инкубируйте еще 48 ч при 37 °C.
- Диссоциируйте инфицированные клетки в одноклеточную суспензию с помощью трипсина, как описано выше. Раскрутите клетки при 200 x g в течение 5 минут и повторно суспендируйте в 500 мкл сортировочного раствора (фосфатно-солевой буфер (PBS) с 1% FBS).
- Пипетируйте клеточную суспензию в пробирки FACS. Совместное окрашивание клеток 1 μл/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) дигидрохлорида для исключения мертвых клеток. Для настройки ворот проточного цитометра требуется отрицательный контроль (нетрансдуцированные клетки и нетрансдуцированные клетки/окрашенные DAPI).
- Отсортируйте флуоресцентно-положительные/DAPI-отрицательные клетки в сортировочный раствор и соберите отсортированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Отсортированные клетки раскрутить при 200 х г в течение 5 минут, удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать в 5 мл питательной среды. Отсортированные клетки высейте в 10-сантиметровую посуду методом пипетирования. Выдерживать при температуре 37 °C не менее 48–72 ч.
- Расширьте отсортированные клетки, диссоциировав клетки, как описано выше, и разложите их на несколько чашек для экспериментов in vivo.
