Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1.FMT Визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с целью эксперимента, клетки глиобластомы, помеченные iRFP, могут контролироваться in vivo до, во время или после лечения. С целью визуализации животных обезболивают с помощью индукционной камеры изофлурана, поддерживают в видеокассете во время сканирования и делают изображение на док-станции тепловизора FMT.
- Извлеките животное из клетки и поместите в индукционную камеру изофлурана. Закройте камеру и включите подачу кислорода и испаритель на 3–5%.
- Наблюдайте за животным до полного обезболивания, обычно в течение 1–2 мин. Животные без сознания не должны реагировать на внешние раздражители.
- Извлеките животное под наркозом из камеры и поместите животное в кассету с визуализацией, поместив сначала адаптер для головы, а затем положив животное лицом вниз. Следите за тем, чтобы головка располагалась в центре кассеты.
- Поместите верхнюю пластину кассеты сверху и затяните регулировочные ручки до 17 мм.
- После того, как животное будет надежно закреплено в кассете для визуализации, перейдите к визуализации, вставив кассету во внутреннюю док-станцию тепловизора FMT, куда закачивается изофлуран для поддержания анестезии животного.
- Запустите программное обеспечение имидж-сканера и анализатора, дважды щелкнув значок программы.
- В окне "Экспериментальная вкладка" выберите раздел "База данных" и "Учебная группа".
- Перейдите в окно "Вкладка "Сканирование" и выберите объект изображения, нажав кнопку "Выбрать объект". Также выберите лазерный канал на панели "Лазерный канал". Для ячеек с маркировкой FP635 выберите «лазерный канал 635 нм», а для ячеек с маркировкой FP720 выберите «лазерный канал 680 нм».
- Чтобы получить изображение, нажмите на опцию «Захват» в окне «Вкладка сканирования». Затем настройте поле сканирования, щелкнув и перетащив поле сканирования на захваченном изображении в определенное количество исходных местоположений, обычно в пределах 20–25 источников для ипсилатеральной стороны.
- Отметьте галочкой опцию «Добавить в очередь реконструкции» и нажмите «Сканировать» в окне «Вкладка сканирования».
- Дождитесь завершения сканирования, а затем извлеките кассету с изображением из док-станции.
- Снимите верхнюю пластину кассеты и поместите животное обратно в клетку.
- Повторите шаги 1.1–1.12 для остальных животных.
2. Анализ изображений
- В программном обеспечении имидж-сканера и анализатора выберите окно «Вкладка «Анализ».
- Загрузите набор данных и объект для анализа, нажав кнопку "+" на панели "Выбор набора данных" окна "Вкладка "Анализ".
- После того, как изображение было загружено в окно «Вкладка «Анализ», выполните анализ области интереса (ROI), выбрав значок эллипсоида, расположенный в верхнем левом углу окна «Вкладка «Анализ».
- Установите порог в ноль на панели "статистические данные", кликнув правой кнопкой мыши по столбцу "порог" в окне "Вкладка "Анализ".
- Общее значение на панели «Статистические данные» представляет собой сигнал от флуоресцентных клеток глиобластомы, имплантированных в мозг мыши.
- Повторите шаги 2.2–2.4 для остальных животных. Загрузите или удалите новый объект, нажав кнопку «+» или «−» соответственно на панели «Выбор набора данных» окна «Вкладка «Анализ».
