Анализ миграции стволовых клеток опухоли головного мозга (BTSC) для исследований лекарственного лечения: метод визуализации живых клеток in vitro для анализа влияния медикаментозного лечения на миграцию BTSC

Аннотация

Источник: Restall, I. et al. Анализы визуализации живых клеток для изучения миграции и инвазии стволовых клеток опухоли головного мозга глиобластомы. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы проводим анализ миграции стволовых клеток опухоли головного мозга, чтобы проанализировать влияние интересующего препарата на миграцию живых стволовых клеток опухоли головного мозга с использованием миграционной пластины хемотаксиса. Визуализация живых клеток облегчает визуализацию и количественную оценку миграции клеток во время анализа.

Протокол

1. Анализ миграции стволовых клеток опухоли головного мозга

1. Засейте 200 000 клеток в колбу T25 в 8 мл готовой среды за 1–2 недели до планирования проведения миграционного анализа.
   заметка: Время между нанесением покрытия и проведением анализа будет варьироваться в зависимости от скорости роста используемой культуры BTSC.
   1. Чтобы проверить влияние лекарственного препарата на миграцию, предварительно обрабатывайте клетки подходящим носителем, таким как ДМСО, и представляющим интерес препаратом, добавляя соответствующие объемы носителя или лекарственного препарата непосредственно в отдельные лунки среды, содержащие клетки.
2. Подготовьте миграционную пластину хемотаксиса (рисунок 1A), покрыв ее тонким слоем коллагена.
   1. Рассчитайте количество лунок 96-луночной хемотаксисной пластины, которую необходимо будет покрыть коллагеном. Включите не менее трех повторяющихся лунок для каждого условия.
   2. Разведите 5 мг/мл запаса коллагена I типа до 0,2 мг/мл в чистой уксусной кислоте, разведенной до 0,14% в культуральной воде.
   3. Пипеткой подайте 0,2 мг/мл коллагена как в лунки мембранных вставок, так и в придонные резервуарные скважины, которые используются.
      заметка: Для нижних резервуаров пластины требуется 225 μL, а для лунок мембранных вставок требуется 75 μL коллагена для надлежащего покрытия.
   4. Поместите миграционную пластину в инкубатор при температуре 37 °C на 1 ч. Аспирируйте раствор коллагена из лунок, не царапая коллагеновое покрытие.
   5. Промойте лунки 2x стерильным 1x PBS. Если планшет не используется сразу, аспирируйте PBS и храните его при температуре 4 °C до 2 недель. Перед использованием нагрейте миграционную пластину хемотаксиса до комнатной температуры.
3. Подготовьте донный резервуар миграционной пластины хемотаксиса.
   1. Пипетку 225 мкл среды (без факторов роста), дополненной 10% FBS в качестве хемоаттрактанта, в придонные пластовые скважины миграционной пластины хемотаксиса.
   2. Аккуратно поместите мембранную вставку в донный резервуар под углом, чтобы избежать образования пузырей.
4. Поместите клетки в мембранную вставку миграционной пластины хемотаксиса.
   1. Ресуспендируйте диссоциированные BTSC в средах (без факторов роста) при плотности клеток 50 000 клеток/мл. Добавляйте препараты в среду при оценке миграции во время различных медикаментозных процедур. Поочередно засевайте равное количество предварительно обработанных клеток и контрольных клеток, сохраняя при этом концентрацию конечного препарата при нанесении покрытия.
   2. Пластину 50 мкл BTSCs из стадии 1.4.1 в каждую лунку миграционной пластины при требуемых условиях обработки.
5. Представьте себе миграцию хемотаксиса.
   1. Поместите пластину для миграции хемотаксиса в систему визуализации живых клеток и настройте программное обеспечение для автоматической визуализации на получение микроскопических изображений пластины каждые 1–2 часа в течение 72 часов. Используя коммерческое программное обеспечение (см. Таблицу материалов), щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и установите интервал сканирования каждые 2 часа в течение 24 часов<бр/> заметка: Временной интервал и общее прошедшее время будут варьироваться в зависимости от используемых культур BTSC; начните с интервалов в 2 часа в течение 72 часов, пока не будет получен опыт работы с отдельными культурами BTSC. Если автоматизированная система визуализации недоступна, то изображения с тем же полем зрения могут быть получены вручную с помощью микроскопа и камеры, подключенных к программному обеспечению для обработки изображений.
   2. После того, как получение изображений будет завершено, получите изображения для всего эксперимента и создайте определение обработки с помощью аналитического программного обеспечения, которое дифференцирует клетки от фона мембраны и миграционных пор (рис. 1B, красная маска). Используя коммерческое программное обеспечение (см. Таблицу материалов), выберите «Новое определение обработки» и установите настройки определения обработки для BTSC на пороговое значение 52, порог роста 85, корректировку размера (пикселей) на -1 и минимальную площадь 200^мкм2. Нанесите это определение обработки на нижнюю сторону мембраны. Модифицируйте этот анализ, если он не позволяет точно отличить клетки от фоновой мембраны.
   3. Соберите данные в виде площади поверхности клетки на нижней стороне мембраны для каждой из трех реплицируемых лунок, в которой подсчитываются только клетки, мигрировавшие через поры. График миграции клеток в μm² (площадь мигрировавших клеток) с течением времени (рисунок 1C).
      заметка: Убедитесь, что относительное количество клеток, покрытых и подсчитанных на верхней поверхности мембраны в первую временную точку, одинаково (менее 20% вариации во всех лунках) при всех условиях обработки, чтобы избежать любых эффектов неравномерного покрытия. Сбор данных с помощью коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалов) можно выполнить, запустив определение обработки, созданное на шаге 1.5.2, нажав на Метрики, затем на График/экспорт, а затем на Экспорт данных.

Результаты

Рисунок 1: Визуализация миграции BTSC в живых клетках. (A) Это пример 96-луночной миграционной пластины хемотаксиса, покрытой тонким слоем коллагена I типа перед проведением анализа миграции с помощью BTSC. На изображениях показаны i) пластина, в которой все три части (крышка, мембранная вставка и резервуар) расположены вместе, ii) все три части разделены, iii) изобр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Матрица Matrigel	Корнинг	No 356230 (Английский
96-луночные планшеты	Эппендорф	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ТермоФишер	156367
Falcon 15 мл коническая трубка	ТермоФишер	352096
Инкуцит ClearView 96-луночный хемотаксис-планшет	Эссен Бионаука	4582
Система анализа живых клеток IncuCyte Zoom	Эссен Бионаука	4545
Программное обеспечение для анализа живых клеток IncuCyte Zoom	Эссен Бионаука	2016A Rev1
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	сигма	Д8537
Культуральная вода	Лонза БиоУиттакер	17-724К
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Инвитроген	12483-020
Крысиный коллаген I	Тревиген	3440-100-01 (Английский)
Решение Accumax для отслойки клеток	Инновационные клеточные технологии	АМ105

)