1. Анализ нейросферной инвазии стволовых клеток опухоли головного мозга
- Засейте 200 000 клеток в 8 мл готовой среды в колбе T25 за 1–2 недели до планирования проведения анализа на инвазию.
заметка: Время от нанесения покрытия до проведения анализа будет зависеть от скорости пролиферации используемой культуры BTSC.
- Для предварительно обработанных клеток добавьте интересующее соединение в колбу в желаемой концентрации в течение заданного периода времени, прежде чем нейросферы будут готовы к инвазии.
- Подождите, пока средний размер нейросферы не достигнет примерно 150–200 мкм; обычно это занимает 7–14 дней, в зависимости от используемой культуры BTSC><.
заметка: Характерно наблюдать распределение размеров сфер в колбе.
- Опрокиньте и аккуратно перемешайте колбу с пипеткой и переместите 500 мл нейросфер BTSC в коническую трубку объемом 1,5 мл для каждого условия лечения; это будет использовано для покрытия трех повторяющихся лунок><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.3.1–1.3.2 являются необязательными, но рекомендуются для первого эксперимента по инвазии на новой культуре BTSC.
- Чтобы определить плотность нейросфер, которые окажутся в лунке, подготовьте пробирку объемом 1,5 мл, как показано на шаге 1.3. Осторожно перемешайте нейросферы и переместите 100 μL в отдельную 96-луночную пластину и дайте нейросферам осесть под действием силы тяжести в течение 5 минут.
- Проверьте количество нейросфер под микроскопом, чтобы убедиться, что несколько нейросфер находятся в области лунки, которая будет визуализирована, без ее переполнения.
заметка: Вторгающимся нейросферам требуется достаточно места, чтобы утроиться в диаметре, не взаимодействуя с соседними нейросферами. Количество нейросфер в лунке можно отрегулировать, подсчитав количество нейросфер в лунке и добавив больше или меньше нейросфер из колбы Т25 в коническую трубку объемом 1,5 мл на шаге 1.3.
- Поместите коническую трубку объемом 1,5 мл с клетками из шага 1.3 на лед и выполните шаги 1,5–1,7 на льду.
- Дайте нейросферам под действием силы тяжести осесть на дно конической трубки объемом 1,5 мл в течение 5 минут и предварительно охладите меченую 96-луночную пластину на льду.
- Ресуспендируйте нейросферы в белке внеклеточного матрикса.
- Приготовьте 500 мкл 0,4 мг/мл раствора коллагена I типа на льду для каждого условия лечения: добавьте 459 мкл среды (без факторов роста), 40 мкл 5 мг/мл стокового раствора коллагена и 0,92 мкл стерильного 1N NaOH (табл. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого условия лечения требуется 500 мкл раствора коллагена: 100 мкл для каждой из трех реплицируемых лунок и 200 мкл избытка. Сюда нужно добавить лекарственные препараты в нужной конечной концентрации, вычтенной из срединного компонента раствора. Этот протокол описывает использование коллагена I типа в качестве белка внеклеточного матрикса; Тем не менее, любой белок внеклеточного матрикса может быть протестирован. Кроме того, для культур BTSC, которые имеют более медленные темпы инвазии, факторы роста или FBS могут быть дополнены в среде для увеличения скорости инвазии.
- После того, как нейросферы из шага 1.5 осядут, аспирируйте как можно больше среды, не теряя гранулу нейросферы, которая осела на дне. Осторожно суспендируйте нейросферы в 500 мкл коллагенового раствора, приготовленного на шаге 1.6.1.
- Добавьте 100 мкл смеси коллагена и нейросферы в три повторяющиеся лунки 96-луночного планшета на льду. Дайте нейросферам осесть на льду в течение 5 минут.
- Перенесите 96-луночный планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 5 минут, чтобы обеспечить полимеризацию коллагена.
- Немедленно подготовьтесь к съемке 96-луночного планшета.
- Поместите 96-луночный планшет в лоток системы визуализации живых клеток или на столик микроскопа, чтобы получить изображение в качестве эталона размера нейросферы на момент нанесения покрытия, до начала инвазии.
- Получайте изображения каждый час до тех пор, пока скорость инвазии не выйдет на плато; обычно это происходит в течение 24 ч.<бр/>
заметка: Интервал визуализации может быть изменен в зависимости от используемого оборудования. Интервал визуализации и общее затраченное время также могут быть изменены для культур BTSC с разной скоростью инвазии.
- Определите увеличивающуюся площадь поверхности BTSC по мере их вторжения в матрицу с течением времени.
заметка: Площадь поверхности клеток на момент нанесения покрытия, рассчитанная как среднее значение трех реплицированных лунок, должна быть одинаковой (менее 20% вариации во всех лунках) между различными условиями обработки, чтобы гарантировать, что различия в инвазии BTSC не сильно зависят от количества или размера покрытых нейросфер.
- Для системы анализа живых клеток используйте 10-кратный объектив для получения изображений и получите четыре изображения в каждой лунке для трех реплицируемых лунок. Чтобы определить относительную площадь поверхности ячейки, представленную в виде процента слияния лунки, настройте определение обработки, которое специально выделяет ячейки на фоне лунки. Используя коммерческое программное обеспечение (см. Таблицу материалов), выберите новое определение обработки и установите корректировку сегментации на 0,8, минимальную площадь на 300мкм2 и максимальную эксцентриситет на 0,99. Измените этот анализ, если он не позволяет точно отличить клетки от фона.
заметка: При использовании других методов визуализации инвазии нейросферы с течением времени рекомендуется получить несколько полей зрения для трех реплицируемых лунок с течением времени. Однако если не отображать одно и то же поле зрения на каждом интервале, это приведет к увеличению стандартной ошибки собранных данных. Компьютерное программное обеспечение может быть использовано для измерения площади поверхности вторгшихся клеток на каждом изображении.
- Соберите данные как общую площадь поверхности ячейки (относительную или абсолютную) для каждой скважины в каждой временной точке и определите среднее значение трех повторяющихся лунок. Построите график инвазии BTSC, построив график увеличения площади клеток с течением времени.
| Приготовление раствора коллагена |
| Бульон [Коллаген] (мг/мл) | 5 |
| Конечный [коллаген] (мг/мл) | 0,4 |
| Количество необходимых скважин: | 5 |
| Общий объем (μл) | 500 |
| Объем запасного коллагена (μл) | 40 |
| Объем 1N NaOH (μл) | 0.92 |
| Объем среды (μл) | 459 |
Таблица 1: Приготовление раствора коллагена I типа 0,4 мг/мл. Перечислены известные начальные и желаемые концентрации раствора коллагена I типа. Перечисленные объемы достаточны для того, чтобы поместить нейросферы в три реплицируемые лунки, плюс две для избытка, и могут включать одно условие обработки, как подробно описано на этапе протокола 1.
