Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка шаблонных слайдов
- Подготовка основания для микроструктурирования
- Обрабатывайте круглые стеклянные покровные стекла диаметром 18 мм воздушной/плазменной активацией в течение 5 мин. Поместите покровные стекла в закрытую камеру со 100 мкл (3-аминопропил) триэтоксисилана в эксикаторе на 1 ч.
- Инкубировать с 100 мг/мл поли (этиленгликоль)-сукцинимидилвалерата (молекулярная масса 5 000 (PEG-SVA)) в карбонатном буфере 10 мМ, pH > 8, в течение 1 ч. Тщательно промыть сверхчистой водой и высушить под химическим колпаком><.
заметка: На этом этапе образец можно хранить при температуре 4°C в темноте для дальнейшего использования.
- Добавьте фотоинициатор, 4-бензоил бензоил триметиламмония хлорид (PLPP), в концентрации 14,7 мг/мл в фосфатно-солевой буфер (PBS).
заметка: Также можно использовать концентрированную форму PLPP, гель PLPP. Это приводит к сокращению времени ультрафиолетового (УФ) освещения, необходимого для разрушения щетки PEG (100 мДж/мм2).
- Фотоинициаторное гелевое осаждение
- Приготовьте смесь из 3 μL геля PLPP и 50 μL абсолютного этанола для нанесения в центр предметного стекла. Поместите образец под химический колпак до полного испарения абсолютного этанола.<бр/>
заметка: На этом этапе образец можно хранить при температуре 4°C в темноте для дальнейшего использования.
- Микроузор на предметном стекле
- Установите покровное стекло в камеру Лудина и поместите его на моторизованный предметный столик микроскопа, оснащенного системой автофокусировки.
- Загрузите изображения, соответствующие задуманным микроузорам, в программное обеспечение. Применяют следующие параметры: повторение 4 х 4 раза, интервал 200 мкм, доза УФ-излучения 1 000 мДж/мм2. После автоматической последовательности УФ-излучения промойте PLPP с помощью нескольких стирок PBS.
заметка: Если использовался гель PLPP, удалите его путем обширной промывки деионизированной водой, высушите в потокеN2 и храните при температуре 4 °C.
- Инкубировать с ламинином (50 мкг/мл в PBS) в течение 30 мин. Обильно промыть PBS.
Примечание: Флуоресцентный раствор очищенного зеленого флуоресцентного белка (GFP, 10 мкг/мл в PBS) может быть смешан с ламинином для визуализации микропаттернов с помощью флуоресцентной микроскопии.
2. Подготовка нейронов и клеток GBM к кокультуре
- Культура нейронов гиппокампа эмбриональной крысы
- Препарируйте гиппокамп эмбриональных (Е18) крыс и перенесите ткань в раствор сбалансированной соли Хенка (HBSS)/1 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES)/пенициллин-стрептомицина в пробирке объемом 15 мл. Удалите излишки раствора, не пересушивая гиппокамп.
- Добавьте 5 мл трипсин-этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА) с добавлением пенициллина (10 000 ЕД/мл)/стрептомицина (10 000 мкг/мл) и 1 мМ HEPES и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C. Промойте 2 раза раствором HBSS/HEPES/пенициллин-стрептомицина и оставьте ткань в этом растворе на 2–3 мин.
- Диссоциируйте ткань с помощью двух отполированных пламенем пипеток Пастера, пипетируя вверх и вниз по 10 раз каждой тканью, стараясь свести к минимуму пенообразование. Подсчитайте клетки и оцените жизнеспособность клеточной суспензии. Поместите нейроны на покровные листы с микроузором, как показано ниже.
заметка: Жизнеспособность клеток составляет 85–90% после экстракции.
- Клеточная культура нейронов на микроузорчатых покровных стеклах
- Регидратируйте стеклянные стекла с микроузором с помощью PBS и инкубируйте полную среду для культуры нейронных клеток.
- Семена нейронов гиппокампа, полученных от крыс E18 Sprague-Dawley, непосредственно над микроузорчатым стеклянным покровным стеклом с плотностью 50 000 клеток насм2 в нейробазальной среде (НБМ), обогащенной 3% лошадиной сывороткой. Поместите микроструктурированные нейроны в инкубатор (37 °C, 5%CO2) на 48 ч.<бр/>
заметка: Через ~6 ч можно увидеть, как первичные нейроны гиппокампа прилипают к микропаттернам ламинина.
- Совместное культивирование стволовых клеток GBM человека на нейронах
- По мере роста сфероидных клеток в суспензии центрифугируйте суспензию в течение 5 мин при концентрации 200 × г. Сфероиды промыть 5 мл PBS и инкубировать клетки с 0,5 мл реагента для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин при 37 °C.
- Добавьте 4,5 мл полного НБМ (в сочетании с добавкой B27, гепарином, фактором роста фибробластов 2, пенициллином и стрептомицином, как описано ранее) и подсчитайте клетки с помощью метода автоматического подсчета.
- Засейте 1000 клеток GBM поверх микроструктурированной культуры нейронов в NBM, обогащенной 3% лошадиной сывороткой. Инкубируйте планшет при 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%.
