Выделение и культивирование первичных перицитов головного мозга: процедура выделения и культивирования перицитов из капилляров головного мозга крупного рогатого скота без контаминации эндотелиальных клеток

Аннотация

Источник: Hørlyck, S. et al. Культура перицитов капилляров мозга для измерения цитозольного кальция и исследований визуализации кальция.J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем процедуру выделения и культивирования перицитов из капилляров головного мозга крупного рогатого скота без контаминации эндотелиальных клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Посев и культивирование бычьих капилляров

1. День 0: Смешайте 0,7 мл коллагена внутривенно с 6,3 мл PBS. Добавьте раствор в колбу T75 и оставьте колбу на 2 часа при комнатной температуре (RT) или оставьте на ночь при температуре 4 °C.
2. Достаньте раствор коллагена из колбы и трижды промойте PBS.
3. Добавьте 7 мл рабочего раствора фибронектина и оставьте колбу на 30 минут при температуре RT. Затем удалите раствор фибронектина и сразу после этого засейте капилляры.
4. В течение 30 минут ожидания разморозьте один флакон капилляров на водяной бане при температуре 37 °C.
5. Когда капилляры оттают, немедленно переложите в центрифужную пробирку с 30 мл DMEM-comp и центрифугируйте в течение 5 мин при 500 x g и RT. Удалите DMEM-comp из пробирки и повторно суспендируйте капиллярную гранулу в 10 мл свежего DMEM-comp.
6. Перелейте суспензию объемом 10 мл в колбу с покрытием T75 и оставьте капилляры прилипать к дну колбы на 4–6 ч в инкубаторе при температуре 37 °C при 10% CO₂,
   заметка: Скорость роста клеток выше при 10%_CO2, а не при обычных 5%_CO2.
7. Через 4–6 ч инкубации осмотреть колбу под световым микроскопом. Фракции капилляров теперь должны быть прикреплены к дну колбы (Рисунок 1, день 0).
8. Приготовьте ГМ и аспирируйте среду DMEN-комп очень осторожно из капилляров и замените ее 10 мл свежеприготовленного ГМ.
9. День 2: Удалите ГМ из капилляров и замените его 10 мл свежеприготовленного ГМ. На этом этапе клеточный нарост из капилляров должен быть виден под световым микроскопом (Рисунок 1, день 2–3).

2. Выделение первичных перицитов из капилляров головного мозга крупного рогатого скота

1. День 4: Осмотрите капилляры под световым микроскопом.
   заметка: Теперь колба должна быть примерно на 60–70% слитой, чтобы обеспечить соответствующее количество перицитов (Рисунок 1, день 4). Если это не так; Замените ГМ на 10 мл свежей среды и оставьте колбу в инкубаторе еще на сутки.
2. Отсадите среду и аккуратно промойте клетки в PBS.
3. Добавьте 2 мл размороженного Трипсина-ЭДТА для эндотелиальных клеток и оставьте колбу в инкубаторе на 1–3 мин. В течение этого периода времени вынимайте колбу почаще и наблюдайте с помощью микроскопа.
   заметка: Эндотелиальные клетки должны округлиться и отделиться от колбы; Перициты должны быть видны как клетки с «призрачной» морфологией и при этом прикрепляться к поверхности колбы. Это сложный и важный шаг.Важно удалить большинство эндотелиальных клеток, чтобы избежать контаминации монокультуры перицитов, но длительная трипсинизация также может привести к отрыву перицитов. Время трипсинизации может время от времени незначительно меняться, поэтому крайне важно часто наблюдать за колбой под микроскопом во время лечения.
4. Осторожно постучите по колбе, когда эндотелиальные клетки начнут округляться, чтобы отделить ослабленные эндотелиальные клетки.
5. Чтобы остановить трипсинизацию, добавьте в колбу 10 мл DMEM-комп. Тщательно промойте колбу несколько раз средой, чтобы удалить эндотелиальные клетки. Аспирируйте суспензию эндотелиальных клеток из колбы. Эндотелиальные клетки теперь могут быть использованы для других целей.
6. Добавьте в колбу 10 мл DMEM-композиции. Посмотрите под световой микроскоп, чтобы убедиться, что перициты все еще присутствуют и прикреплены к дну. Поместите колбу обратно в инкубатор, чтобы культура, обогащенная перицитами, могла вырасти.
   заметка: Важно наблюдать за культурой в течение последующих дней. Если все еще растет достаточное количество эндотелиальных клеток, можно провести еще одно лечение трипсином.
7. Дайте монокультуре перицитов расти со сменой среды DMEM-комп. каждые два дня. Проверьте рост клеток под световым микроскопом (рисунок 1, день 5–8).

Результаты

Рисунок 1: Культивирование капилляров и выделение перицитов.Капилляры были выделены из свежего мозга крупного рогатого скота и засеяны в колбы с культурой на 0-й день. Вырост из капилляров головного мозга крупного рогатого скота и последующее выделение перицитов отслеживались в течение нескольких дней с помощью светового микроскопа. На день 4a показан рост эндотелиальных клеток до лечения трипсином д...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ПБС	Сигма Олдрич	Д8537	Фосфатно-солевой буфер
Коллаген IV	Сигма Олдрич	С5533
Фляга Т-75	Сигма Олдрич	CLS3972
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	PAA/GE Здравоохранение	А15-101
Фибронектин	Сигма Олдрич	Ф1141
Трипсин-ЭДТА	Сигма Олдрич	Т4299
оптический микроскоп	Олимп	Olympus CK2	Вертикальный световой микроскоп с фазовым контрастом
Дмсо	Сигма Олдрич	471267
Гепарин	Сигма Олдрич	Н3149
Клеточный инкубатор	Термо Фишер
центрифуга	Термо Фишер	Heraeus Multifuge 3SR+	Стандартная центрифуга большого объема для вращающихся ячеек
Модифицированный Eagles от Dulbecco Medium	Сигма Олдрич	Д0819
Пенициллин G Натрий/Стрептомицина сульфат	Сигма Олдрич	П0781
Заменимые аминокислоты MEM	Сигма Олдрич	М7145