Выделение церебральных капилляров из мозга человека: оптимизированный метод извлечения церебральных капилляров из ткани мозга человека

Аннотация

Источник: Hartz, A. M. S. et al. Выделение церебральных капилляров из свежей ткани мозга человека. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео показано выделение церебральных капилляров из свежей ткани мозга человека. Затем выделенные капилляры могут быть использованы для создания модели гематоэнцефалического барьера ex vivo.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Подготовка образцов мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1A показана схема рабочего процесса всей процедуры изоляции, описанной ниже. Ткань человеческого мозга может быть получена из любой части коры головного мозга и может быть использована в свежем или замороженном виде. Замороженную мозговую ткань можно размораживать при комнатной температуре (без буфера; ~30 мин для 10 г). Для достижения сопоставимых результатов ткань мозга должна быть получена из одной и той же области мозга для каждого эксперимента. Этот протокол оптимизирован для свежей (Post-Mortem Interval или PMI <4 ч) коры головного мозга человека, которая не была заморожена.

1. Подготовка мозговой ткани человека: Задокументируйте вес мозговой ткани. Все цифры в следующем протоколе подходят для 10 г свежей ткани мозга человека. Поместите мозговую ткань в чашку Петри диаметром 100 мм. Аккуратно удалите все мозговые оболочки с помощью щипцов. С помощью скальпеля отрежьте белое вещество.
2. Измельчение мозговой ткани человека: Аккуратно разрежьте мозговую ткань и измельчите ее скальпелем. Пропустить через мясорубку около 5 минут (2–3 мм штуки). Перенесите мозговую ткань в измельчитель тканей Potter-Elvehjem. Добавьте 30 мл изоляционного буфера.
   заметка: Кусочки измельченной ткани трудно разглядеть, так как в процессе измельчения мозговая ткань превращается в кашу.

2. Гомогенизация

1. Тканевый измельчитель Potter-Elvehjem (зазор: 150–230 мкм): Гомогенизируйте каждый образец за 100 ходов при скорости гомогенизатора 50 об/мин. Запишите время каждые 25 ударов и общее время, необходимое для 100 ударов. В таблице 1 приведен предлагаемый протокол гомогенизации; Общее время гомогенизации 10 г лобной коры человека составляет около 22 мин. Не втягивайте воздух во избежание образования пузырьков.
2. Гомогенизатор Dounce (зазор: 80–130 мкм): Перенесите гомогенат в гомогенизатор Dounce на льду. Гомогенизируйте суспензию за 20 ходов (~6 с/ход, всего ~2 мин). Избегайте образования пузырей.

3. Центрифугирование

1. Равномерно распределите гомогенат мозга по четырем центрифужным пробиркам объемом 50 мл и задокументируйте общий объем гомогената. Распределите 50 мл буфера градиента плотности в центрифужные пробирки (12,5 мл на пробирку). Используйте 10 мл изоляционного буфера для промывки пестика и гомогенизатора и распределите по четырем центрифугирующим пробиркам (~2,5 мл на пробирку).
2. Плотно закройте пробирки центрифуги крышками. Смешайте гомогенат, среду с градиентом плотности и буферизацию, энергично встряхивая пробирки. Центрифуга при давлении 5 800 x g в течение 15 мин при 4 °C (ротор с фиксированным углом); Выберите среднюю скорость замедления, чтобы пуля оставалась прикрепленной к трубке. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 2 мл 1% BSA.

4. Фильтрация

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отделить капилляры от эритроцитов и другого клеточного мусора, необходимо несколько этапов фильтрации.

1. Меш 300 μм: После повторного взвешивания гранулы отфильтруйте суспензию через ячейку 300 μм. Капилляры фильтруются через сетку, в то время как более крупные сосуды и более крупные мозговые остатки остаются на сетке. Тщательно промойте сетку до 50 мл 1% BSA. Выбросьте сетку.
   заметка: Этот этап фильтрации очищает капиллярную суспензию от любых крупных сосудов или кусков мозгового мусора.
2. Фильтр для деформации клеток 30 мкМ
   заметка: Этот этап фильтрации отделяет капилляры от эритроцитов и других остатков мозга.
   1. Распределите капиллярный фильтрат из шага 4.1 по пяти фильтрам клеточного штамма по 30 мкм (около 10 мл капиллярного фильтрата на фильтр клеточного штамма). Капилляры удерживаются этим фильтром, в то время как эритроциты, другие одиночные клетки и мелкие остатки мозга проходят через фильтр и собираются в фильтрате.
   2. Промойте каждый фильтр 25 мл 1% BSA. После этого вылейте все фильтраты через шестой фильтр для увеличения выхода. Промойте каждый фильтр 50 мл 1% BSA; Сохраняйте фильтры клеточного штамма с содержащими капилляры и выбросьте фильтрат.

5. Капиллярный сбор

1. Переверните фильтры вверх дном и промойте капилляры 50 мл 1% BSA для каждого фильтра в пробирки объемом 50 мл. Осторожно надавите кончиком пипетки объемом 5 мл и переместите его по фильтру, чтобы смыть капилляры мозга.
2. Обязательно смойте все капилляры мозга, особенно с края фильтра. Избегайте образования пузырьков, так как это затрудняет процесс фильтрации и увеличивает вероятность потери капилляров.

6. Стирка

1. После сбора капилляров центрифугируйте все образцы при давлении 1 500 x g в течение 3 минут при 4 °C (качающийся ротор ведра). Удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу примерно в 3 мл изоляционного буфера. Соедините все ресуспендированные гранулы из одного образца в конической пробирке объемом 15 мл и заполните ее изоляционным буфером. Снова центрифугируйте при 1 500 x g в течение 3 минут при 4 °C и промойте еще два раза.
2. Задокументируйте чистоту капилляров с помощью микроскопа (100-кратное увеличение) и фотоаппарата (рис. 1B).
   заметка: Выход капилляров мозга из 10 г мозговой ткани человека обычно составляет около 100 мг. Изолированные капилляры мозга теперь можно использовать для экспериментов, обрабатывать (например, лизат, мембранная изоляция) или замораживать и хранить при температуре -80 °C в криопробирках в течение как минимум 6–12 месяцев (избегайте многократных циклов замораживания-размораживания).

лет

Штрихи	Время
1–25	7–7,5
26–50	5–5,5
51–75	5–5,5
76–100	5–5,5
Общее время:	22–24 мин

Таблица 1: Протокол гомогенизации. Протокол гомогенизации для измельчителя тканей Potter-Elvehjem для гомогенизации 10 г лобной коры головного мозга человека со скоростью гомогенизации 50 об/мин. Учтите, что первые несколько ударов требуют дополнительного времени для гомогенизации измельченной ткани. После этой первоначальной гомогенизации продолжительность каждого удара составляет 12 с (6 с для движения вниз, 6 с для движения вверх). Таким образом, после первоначальной гомогенизации можно выполнить 5 ударов за 1 минуту или 25 ходов за 5 минут.

Результаты

Рисунок 1: Блок-схема для капиллярной изоляции. (А) Пиктограмма иллюстрирует основные этапы процедуры выделения капилляров головного мозга из свежей ткани человека. (B) На рисунке показаны изолированные капилляры мозга человека под световым микроскопом сразу после выделения (100-кратное увеличение).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Средства индивидуальной защиты (СИЗ)
Латексные перчатки Diamond Grip Plus, Microflex Medium	VWR, Раднор, Пенсильвания, США	32916-636 (Английский)	СИЗ
Одноразовые защитные лабораторные халаты	VWR, Раднор, Пенсильвания, США	470146-214	СИЗ; из-за характера исходного материала для человека рекомендуется использовать одноразовый лабораторный халат.
Лицевой щиток, одноразовый	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	19460102	СИЗ; из-за характера исходного материала для человека рекомендуется использовать одноразовый лицевой щиток
Материалы для безопасности
Высокотемпературные автоклавные пакеты Clavies 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	Тел.: 01-815-6
Versi Сухая Настольная Бумага 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	14-206-32	Для покрытия рабочих зон
Контейнерные системы VWR Sharps	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	75800-272	Для бывших в употреблении скальпелей
Отбеливатель 8,2% Clorox Germicidal 64 унции	Центр поставок в Великобритании, Лексингтон, штат Кентукки, США	323775
Оборудование
Холодильник 4 °C	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	Тел.: 13-986-148
pH-метр Accume BASIC AB15	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	АВ15
Управление Heidolph RZR 2102	Хейдольф, деревня Элк-Гроув, Иллинойс, США	501-21024-01-3
Центрифуга Sorvall LEGEND XTR	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	75004521
Препарирующий микроскоп Leica L2	Leica Microsystems Inc, Буффало-Гроув, штат Иллинойс, США		Используется для удаления мозговых оболочек
Гомогенизатор POLYTRON PT2500	Kinematica AG, Люцерн, Швейцария	9158168
Весы-403	Denver Instrument, Богемия, Нью-Йорк, США	191392
Стандартный мини Stir	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	1151050
Термоколбы с жидким азотом Дьюара	Thermal Scientific, Мансфилед, Техас, США	11-670-4С	Используется для замораживания ткани
Аналитические весы Voyager Pro	OHAUS, Парсиппани, Нью-Джерси, США	VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope	Carl Zeiss, Inc Торнвуд, штат Нью-Йорк, США		Используется для проверки изолированных капилляров
Инструменты и стеклянная посуда
Пипетка Finnpipette II 1-5 мл	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	No 21377823Т1	Промыть капилляры с фильтра
Пипетка Finnpipette II 100-1 000 μл	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	No 21377821Т1	Ресуспендия пеллеты в БСА
Мальчик с пипеткой	Integra, Гудзон, Нью-Гэмпшир, США	739658
50 мл Falcon Tubes 25/штатив - 500/cs	VWR, Раднор, Пенсильвания, США	No 21008-951
Скальпельные лезвия EISCO	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	S95938C	Измельчить мозговую ткань
ПАРАФИЛЬМ	VWR, Раднор, Пенсильвания, США	52858-000	Для накрытия стакана и мерной колбы
Наконечники для пипеток Finntip от Thermo Scientific 5 мл	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	Тел.: 21-377-304	Для промывания капилляров от фильтра
Шприц 60 мл с люэр-локом	Thermo Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	BD309653	Используется с соединительным кольцом для фильтрации капилляров
Ручка скальпеля #4	Fine Science Tools, Фостер-Сити, Калифорния, США	10060-13	Используется для измельчения
Щипцы Dumont #5	Fine Science Tools, Фостер-Сити, Калифорния, США	11251-10	Используется для удаления мозговых оболочек
Potter-Elvehjem Измельчитель тканей	Thomas Scientific, Сведенсборо, Нью-Джерси, США	3.43Э+28	Объем 50 мл, клиренс: 150-230 мкм
Гомогенизатор Dounce	VWR, Раднор, Пенсильвания, США	62400-642	Объем 15 мл, клиренс: 80-130 μм
Спектральные/сетчатые тканые фильтры (300 мкм)	Spectrum Laboratories, Ранчо Домингес, Калифорния, США	146424	Используется для фильтрации капиллярной суспензии для удаления любых оставшихся оболочек
pluriSits (размер пор: 30 мкм)	pluriSelect Life Science, Лейпциг, Германия	43-50030-03
Соединительное кольцо	pluriSelect Life Science, Лейпциг, Германия	41-50000-03	Повторное использование несколько раз
Мерная колба объемом 1 л			Для приготовления изоляционного буфера
1 л стакана			Для приготовления 1% БСА
Бар для перемешивания			Для приготовления 1% BSA и Ficoll®
Бутылка Шотта (60 мл)			Для приготовления Ficoll®
Ведро со льдом			Чтобы все было холодным
Чашка Петри 100 мм			Для измельчения мозговой ткани
Скребок для клеток тканевых культур	VWR, Раднор, Пенсильвания, США	89260-222	Для удаления надосадочной жидкости после центрифугирования
Химикаты
БСА Фракция V, А-9647	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	А9647-500г	Готовьте в DPBS с Ca2+ и Mg2+ накануне. Избегайте образования пузырей во время приготовления. Хранить в холодильнике. Медленно перемешивайте в течение 10 минут перед использованием.
DPBS с Ca2+ и Mg2+	Гиклон	SH30264.ФС	DPBS - часть буфера изоляции
Фиколл PM400	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Ф4375	Здесь важны точные измерения. Взвесьте в бутылке с мешалкой. После добавления DPBS энергично встряхните. Хранить в холодильнике О/Н. Утром будет ясно. Перед использованием аккуратно перемешайте в течение 10-15 минут. Держите на льду до использования.
Глюкоза (D-(+) декстроза)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Г7528	Концентрация глюкозы (D-(+) декстрозы): 5 мМ
Стандартный раствор гидроксида натрия	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	71474	Для регулировки рН DPBS
Пируват натрия	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	П2256	Концентрация: 1 мМ