Флуоресцентная пептидная зимография: модифицированная методика определения активности протеазы с использованием флуорогенных субстратов в гелях зимограммы

Аннотация

Источник: Deshmukh, A. A. et al. Обнаружение активности протеазы с помощью флуоресцентной пептидной зимографии. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы выполняем зимографию, электрофоретический метод, чтобы проанализировать протеолитическую активность биологических образцов.

Протокол

1. Электрофорез биологических образцов в пептидных зимографических гелях

1. Растворите образцы в обычном буфере для образцов для зимографии (62,5 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 25% глицерина, 4% SDS, 0,01% бромфенолового синего). Для образцов клеток и тканей рекомендуется ~30 мкг общего белка на лунку и 50–100 нг белка для стандартов MMP.
2. Добавьте 400 мл 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer в гелевый аппарат. Загрузите до 35 мкл образца в лунку. Проведите испытания при напряжении 120 В при 4 °C в течение 1,5 часов или до тех пор, пока стандарты молекулярной массы не укажут, что интересующие протеазы находятся в слое пептидного разрешающего геля (который имеет видимый оранжевый цвет).
   заметка: Большинство MMP и их разновидностей находятся в диапазоне 35–100 кДа. Когда стандарты молекулярной массы указывают на то, что эти массы находятся в слое пептида-разрешающего геля, электрофорез можно остановить. Тот же принцип может быть применен и к другим классам протеаз с известными молекулярными массами. Если есть интерес к обнаружению множественных протеаз в большем диапазоне молекулярных масс, уменьшите размер разрешающего гелевого слоя и увеличьте размер пептидного разрешающего гелевого слоя.
3. После электрофореза извлеките гели из пластиковой кассеты и промойте гели три раза в течение 10 мин каждый при комнатной температуре при осторожном перемешивании в ренатурирующем буфере, содержащем 2,5% Triton X-100, 1 мкМ ZnCl₂ и 5 мМ CaCl₂ в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5.
4. Переложите гели в проявочный буферный раствор, содержащий 1% Triton X-100, 1 мкМ ZnCl₂ и 5 мМ CaCl₂ в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5 в течение 15 мин. Замените свежим проявляющим буферным раствором и инкубируйте гели при 37 °C при осторожном перемешивании в течение 24 часов, убедившись, что гели полностью погружены в раствор.
5. Через 24 часа изображение гелизируется с помощью флуоресцентного гелевого сканера/имидж-сканера с использованием соответствующих возбуждающих и эмиссионных фильтров.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пустые гелевые кассеты 1,5 мм	ThermoFisher Scientific	НК2015
Решение 20% SDS	Амбион	АМ9820
3x Буфер для образцов для зимографии	Био-Рад	1610764
Набор Azido-PEG3-Maleimide	Нажмите «Инструменты химии	АЗ107
Базовый блок питания PowerPac	Био-Рад	1645050
Прецизионный плюс Протеин Двухцветный Стандарт	Био-Рад	161-0374 (Английский)
Иглы для подкожных инъекций PrecisionGlide	Научный центр Фишера	Телефонный номер: 14-826