Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Система сфокусированного ультразвука
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная установка представляет собой собственную систему разрушения BBB, основанную на коммерчески доступных компонентах, и включает в себя напечатанный на 3D-принтере специальный конус и съемную стереотаксическую платформу. Система спроектирована модульно, что облегчает внесение изменений в соответствии с имеющимся оборудованием и спецификой использования. Протокол описывает процедуру сонопорации большей области в понтинной области мозга мыши. Регулируя целевое местоположение, можно воздействовать на различные части мозга. В данном исследовании использовался одноэлементный преобразователь с частотой 1 МГц с фокусным расстоянием 75 мм, апертурой 60 мм и фокусной областью 1,5 x 1,5 x 5 мм (FWHM пикового давления). Фокальная плоскость преобразователя располагается через черепную коробку животного в горизонтальной плоскости, пересекающейся с ушными планками.
- Выберите подходящий преобразователь для вскрытия ГЭБ у грызунов.
заметка: В зависимости от свойств микропузырьков и используемой частоты акустические настройки, в частности механический индекс (MI), могут быть изменены.
- Поместите датчик в напечатанный на 3D-принтере конус.
- Используйте акустически прозрачную майларовую мембрану на нижнем конце конуса для достижения акустической связи пути распространения луча и заполните конус дегазированной водой.
- Установите датчик над животным на моторизованную линейную сцену, как показано на рисунке 1, что обеспечивает автоматическое вертикальное позиционирование датчика.
- Спроектируйте съемную стереотаксическую платформу на основе требований исследования, которая включает в себя температурно регулируемый нагрев, прикус и ушные планки, анестезию и мультимодальные реперные маркеры, как показано на рисунках 1 и 2. Крепление стереотаксической платформы состоит из 2D линейной сценической системы, которая обеспечивает точное автоматическое позиционирование (< 0,1 мм) животного под лучом.
- Подключите преобразователь к цепи акустической эмиссии, показанной на рисунке 1, состоящей из преобразователя, функционального генератора и усилителя мощности.
- Разработка конвейера обработки изображений для обнаружения мультимодальных реперных маркеров, которые позволяют точно нацеливаться сонопорацией на интересующую область мозга и собирать данные о кавитации, обнаруженные игольчатым гидрофоном.
- Откалибруйте систему и определите точку фокусировки датчика в соответствии с вертикальным положением животного на стереотаксической платформе.
2. Подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол указан для мышей, но может быть адаптирован для крыс. Для этих экспериментов использовались самки атимических обнаженных мышей Foxn1-/- (в возрасте 6–8 недель).
- Дайте животному акклиматизироваться в течение как минимум одной недели в животноводческом помещении и регулярно взвешивайте животное.
- Вводите бупренорфин (0,05 мг/кг) подкожно за 30 минут до лечения FUS для начала лечения обезболивающими.
- Обезболите животное 3% изофлураном, 2 л/мин О2 и убедитесь, что животное глубоко обезболито. Держите животных под наркозом в течение всей процедуры и контролируйте частоту дыхания и частоту сердечных сокращений, чтобы регулировать концентрацию изофлурана по мере необходимости.
- Наносите глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз и избежать возможных травм.
- Удалите волосы на макушке с помощью бритвы и крема для депиляции, а затем промойте водой, чтобы удалить остатки и избежать раздражения кожи.
- Для экспериментов с моделями опухолей BLI введите 150 мкл D-люциферина (30 мг/мл) внутрибрюшинно (в/в) с помощью инсулинового шприца 29G для визуального контроля BLI.
- Введите катетер хвостовой вены 26–30G и промойте катетер и вену небольшим объемом раствора гепарина (5 ЕД/мл). Заполните катетер раствором гепарина, чтобы избежать свертывания крови.
заметка: Хорошая катетеризация наблюдается при возврате крови в катетер. Избегайте попадания пузырьков воздуха в катетер, чтобы предотвратить эмболию. Чтобы избежать чрезмерного давления инъекции, убедитесь, что длина катетера как можно короче.
- Поместите животное на стереотаксическую платформу с регулируемой температурой, чтобы избежать переохлаждения.
заметка: Гипотермия снижает циркуляцию крови, что может повлиять на инъекцию/циркуляцию микропузырьков и фармакокинетику лекарственных препаратов.
- Обездвижьте и зафиксируйте голову животного на стереотаксической платформе с помощью ушных планок и прикусочной планки. Зафиксируйте тело ремнем и прикрепите хвост животного к платформе.
3. Фокусированный ультразвук in vivo под визуальным контролем
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола был использован одноэлементный преобразователь 1 МГц с тональным импульсом длительностью 10 мс, MI 0,4 и частотой повторения импульсов 1,6 Гц с 40 циклами по 240 с. Протокол оптимизирован для микропузырьков, стабилизированных фосфолипидами, содержащими гексафторид серы (SF6) в качестве безвредного газа, при этом средний диаметр пузырьков составляет 2,5 мкм, а более 90% пузырьков меньше 8 мкм.
- Поместите стереотаксическую платформу с установленным на ней животным в режим визуализации (например, BLI или рентген) и сделайте изображение (изображения) животного.
- Используйте мультимодальные реперные маркеры в сочетании с конвейером обработки изображений, чтобы отметить положение животного в соответствии с точкой фокусировки датчика.
- Определите целевую область, поместив контур мозга поверх полученного рентгеновского снимка или используя изображения BLI для определения центра опухоли (рис. 2). Положение конкретных частей мозга указано в Атласе мозга Paxinos с использованием отметин черепа bregma и lambda в качестве ориентиров. Например, мост расположен от лямбды x=-1.0, y=-0.8 и z=-4.5.
- Закройте ноздри и рот животного клейкой лентой, чтобы ультразвуковой гель не мешал дыханию.
- Нанесите ультразвуковой гель на макушку головы животного.
- Втяните кожу шеи животного, смажьте игольчатый гидрофон ультразвуковым гелем и поместите игольчатый гидрофон в непосредственной близости от затылочной кости.
- Направьте датчик в правильное положение с помощью конвейера обработки изображений и точки фокусировки.
- Примените предварительно настроенные настройки ко всем подключенным устройствам и нацельтесь на интересующую область мозга.
заметка: В зависимости от исследовательского вопроса, опухоли или области мозга могут быть сонопорированы как единая фокальная точка или как объемная форма, как показано на рисунке 2.
- Активируйте микропузырьки так, как описано производителем. Введите один болюс 120 мкл (5,4 мкг) микропузырьков.
- Промойте катетер хвостовой вены физиологическим раствором, чтобы проверить отверстие катетера.
- Введите микропузырьки и запустите озвучивание.
- Запишите кавитацию микропузырьков с помощью игольчатого гидрофона.
- Вводят внутрисосудистое контрастное вещество или лекарственное средство после сонопорации. Доза, сроки и планирование зависят от цели исследования и принимаемого препарата.
заметка: Синий Эванса является распространенным цветовым агентом для оценки раскрытия ГЭБ.
- Наблюдайте за животным до заданного момента времени или до гуманной конечной точки.
