Внутриутробная электропорация на основе доставки генов: метод введения плазмидной ДНК в эмбриональные клетки мозжечка мышиных эмбрионов

Аннотация

Источник: Feng W. et al. CRISPR-опосредованный анализ потери функции в гранулярных клетках мозжечка с использованием внутриутробного переноса генов на основе электропорации. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует доставку плазмидной ДНК в нейронные клетки мозжечка мышиных эмбрионов с помощью внутриутробной электропорации. Этот метод полезен для понимания функции генов in vivo в нормальном развитии мозга и изменений в экспрессии генов нейронных клеток во время прогрессирования опухоли.

Протокол

1. Выполнение внутриутробной электропорации

1. Разведите мышей в возрасте от 6 до 8 недель и подготовьте инструменты для внутриутробной электропорации. Скрещивание самцов гомозиготных мышей Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP с самками мышей CD-1. Отсчитывайте время беременности у мышей с CD-1 со дня обнаружения вагинальной пробки (E0,5). Эмбрионы подвергаются электропорации на день Е13.5.
   1. Вытягивайте капилляры из боросиликатного стекла (внутренний диаметр: 0,6–0,8 мм) с помощью съемника микропипетки. Используйте следующие настройки: P = 500, Heat = 560, Pull = 150, Vel = 75, Time = 250. Пометьте кончик капилляра черными чернилами для лучшей визуализации во время инъекции. Обрежьте конус капилляра под стереомикроскопом с помощью линейки и острого игольчатого пинцета и обрежьте кончик на длину около 6 мм.
   2. Поддерживайте единство капилляров, чтобы эксперимент был воспроизводимым. Создайте односторонний скошенный край во время обрезки. Кончик должен быть как можно более острым для легкого проникновения в стенку матки и во избежание повреждения тканей эмбриона.
      заметка: В качестве альтернативы используйте микрокофемолку для регулировки угла 35°. Капилляры можно хранить при комнатной температуре в чашке Петри высотой 10 см в условиях, свободных от патогенов.
   3. Автоклавирование хирургических инструментов.
   4. Смешайте sgRNA-плазмиды в равных частях с pT2K-IRES-Luc до конечной концентрации не менее 1 мкг/мкл для каждой плазмиды и окрасьте раствор плазмиды в быстрый зеленый цвет (конечная концентрация 0,05%). Приготовьте 1% быстрый раствор зеленого материала из дистиллированной воды, не содержащей эндотоксинов, и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм для удаления частиц красителя из раствора.
      заметка: Котрансфекция pT2K IRES-Luc является необязательной, но позволяет идентифицировать жизнеспособных электропорированных животных после рождения с помощью биолюминесцентной визуализации. Приготовьте достаточное количество плазмидной смеси для общего числа беременных мышей, подлежащих операции. Используйте около 15–20 μL смеси на одну мышь (~12 эмбрионов). Немедленно приступайте к операции.
2. Подготовка мышей к операции
   1. Обезболите беременных мышей CD-1 изофлураном. Вызвать анестезию в боксе с 3–4 об.% изофлурана (скорость потока кислорода: 1,5 л/мин) и поддерживать его на уровне 2 об.% во время операции через носовой конус.
      заметка: Полная операция не должна занимать более 30 минут. При необходимости уменьшите количество вводимых и электропорированных эмбрионов. Используйте стерильные перчатки для операции.
   2. Положите мышь на спину на грелку и отрегулируйте анестезию.
   3. Ввести анальгетик (Метамизол, 800 мг/кг массы тела, подкожно (подкожно), 24 ч депо).<бр/> заметка: Вы можете использовать другие разрешенные анальгетики, кроме метамизола.
   4. Наносите глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции.
   5. Зафиксируйте конечности скотчем и простерилизуйте брюшную полость дезинфицирующим средством. Накройте мышь марлей, оставив открытой только операционную область. Нанесите 70% этанол на операционную область и марлю.
   6. Сделайте надрез кожи длиной около 2 см и аккуратно расширьте промежуток прямыми хирургическими ножницами. Найдите белую линию и сделайте чуть меньший второй разрез через брюшину с помощью тканевых ножниц с тупым концом.
   7. Смочите вскрытую брюшную полость предварительно подогретым стерильным 1x PBS.
   8. Осторожно извлечь рога матки из брюшной полости с помощью кольцевых щипцов. Тяните аккуратно, захватывая стенку матки исключительно в промежутке между желточными мешочками двух соседних эмбрионов. Избегайте любого давления на эмбрион во время протягивания его через разрез. При необходимости увеличьте разрез и соблюдайте особую осторожность, чтобы расположить маточные рога на животе, не сжимая кровоток через маточную артерию.
      заметка: В некоторых случаях рекомендуется извлекать по одному маточному рогу за раз и заменять его, прежде чем приступать ко второму маточному рогу.
3. Инъекция и электропорация плазмидной ДНК
   1. Отсадите примерно 15 мкл цветного плазмидного раствора с приготовленным стеклянным капилляром. Избегайте образования пузырьков воздуха во время этого процесса.
      заметка: Плазмидный раствор может легко закупорить наконечник, если его концентрация высока. Проверьте капилляр, выпустив некоторое количество ДНК непосредственно перед инъекцией.
   2. Аккуратно удерживайте эмбрион кольцевыми щипцами и найдите область шеи.
      заметка: Если эмбрион находится в положении, которое трудно ввести инъекции, пропустите его и перейдите к следующему эмбриону. Более частое изменение положения эмбриона может увеличить вероятность его повреждения.
   3. Медленно прокалывайте кончиком заранее подготовленного стеклянного капилляра в четвертый желудочек, проникая через дорсальный задний мозг и впоследствии вводите около 1 мкл плазмидной смеси. Подтвердите, что окрашенная ДНК не утекает из мозга и видна в виде ромбовидной структуры.
      заметка: Как вариант, используйте 2,5-кратную лупу для лучшей визуализации четвертого желудочка и окружающих его кровеносных сосудов. Подавайте электрические импульсы сразу после инъекции, чтобы предотвратить диффузию плазмидного раствора в другие желудочки.
   4. Подайте электрические квадратные импульсы (5 импульсов, 32 мВ, 50 мс вкл., 950 мс выкл.) с помощью платинового пинцета, похожего на щипцы (см. Таблицу материалов). Расположите электроды латерально, отрицательный полюс должен закрывать ухо, а положительный полюс — в мозжечковом зачатке над стенкой матки. Используйте электродные пластины диаметром 5 мм для эффективной электропорации эмбрионов E13.5.
      заметка: Увеличьте выживаемость детенышей путем манипулирования менее чем 2/3 от общего количества эмбрионов на одну мать. Избегайте закладки эмбрионов слишком близко к шейке матки. При манипуляциях они могут вызвать осложнения во время родов и поставить под угрозу весь помет. Если электроды находятся слишком близко к сердцу эмбриона, это может привести к остановке сердца.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоклавная лента	Kisker Biotech	150262
Электроквадратный поратор	БТХ	ЭСМ830
Комплект Endofree Maxi	Цягэн	No 12362
этанол	Мерк	107017
Глазная мазь (Бепантен)	Байер	81552983
Быстрый зеленый	Мерк	104022
Фильтр (0,22 мкм)	Мерк	Ф8148
Щипцы прямые	Инструменты для точной науки	91150-20
Марля (X100 ES-pads 8f 10 x 10 см)	Научный центр Фишера	15387311
Стеклянный капилляр с нитью накаливания	Нарисигэ	ГД1-2
Грелку	ТермоЛюкс	463265 / -67
Изофлуран	Зоетис	TU061219
Кольцевые щипцы	Инструменты для точной науки	11103-09
Стереомикроскоп	Компания Nikon	К-ПС
Хирургические ножницы	Инструменты для точной науки	91460-11
Хирургические ножницы с тупым концом	Инструменты для точной науки	14072-10
Пинцет с 5 мм - дисковые электроды Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Метамизол	WDT
Нестерильная шелковая шовная нить (0,12 мм)	Инструменты для точной науки	18020-50
ПБС (1шт.)	Технологии Life	14190169
Ножницы для салфеток Blunt (11,5 см)	Инструменты для точной науки	14072-10
pCAG-EGxxFP	Адджен	50716
Плазмида pX330	Адджен	42230

гг.