Модель периневральной инвазии мыши: создание модели in vivo для моделирования периневральной инвазии в седалищном нерве мыши

Аннотация

Источник: Deborde, S. et al. Модель периневральной инвазии мышиного седалищного нерва in vivo. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы разрабатываем мышиную модель in vivo для периневральной инвазии путем инъекции раковых клеток поджелудочной железы в седалищный нерв. Эта модель помогает количественно оценить степень инвазии и изучить взаимодействие между раковыми клетками и нервами.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка мышей и хирургическое вмешательство

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании используются 8-недельные самцы и самки мышей C57BL/6J. Условия операции соответствуют правилам IACUC нашего учреждения. Инструменты стерилизуются, хирургическая рабочая поверхность дезинфицируется, животное дезинфицируется, а хирург надевает стерильные перчатки.

1. За день до операции обезболите мышь 2% изофлураном, а затем удалите шерсть по длине бедренной кости на тыльной стороне с помощью тонкой бритвы или химического средства для удаления волос.
2. В день операции сделайте мышам анестезию с использованием 2% изофторана в индукционной камере. Подтвердите обезболивание раздражителем с пощипыванием пальца ноги и отсутствием реакции.
3. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
4. Положите мышь под наркозом на брюшную сторону и аккуратно зафиксируйте каждую конечность гипоаллергенной лентой, чтобы создать легкое напряжение в конечности, которую нужно инъецировать. Анестезия поддерживается с помощью изофлурана, подаваемого через прецизионный испаритель и носовой конус.
5. Очистите место инъекции Бетадином, затем снова 70% спиртом. Повторите этот процесс еще два раза. Следите за тем, чтобы на операционном поле не осталось выпавших волос.
6. Сделайте разрез небольшими ножницами на 1 см примерно на 2 мм ниже и параллельно бедренной кости. Втяните кожу щипцами в сторону, чтобы обнажить мышцы под ней.
7. Седалищный нерв проходит вглубь большой ягодичной мышцы и двуглавой мышцы бедра. Разделите эти две мышцы вдоль фасциальной плоскости с помощью маленьких ножниц и обнажите седалищный нерв под ними. Освободите нерв от окружающих мышц с помощью тупого рассечения.
8. Наберите 3 мкл раковых клеток (около 50 000 клеток) из гранулы в шприц объемом 10 мкл.
   заметка: В качестве альтернативы можно использовать 3 мкл PBS в качестве контроля.
9. Поместите небольшой металлический шпатель под нерв в месте инъекции для поддержки. Под визуализацией с помощью препарирующего микроскопа введите иглу в нерв напротив металлического основания, сохраняя иглу как можно более параллельной нерву при введении. Будьте осторожны, чтобы не проколоть заднюю часть нерва. Сведите к минимуму воздействие на нервы на протяжении всего этого процесса.
10. Медленно вводите в нерв в течение 5 с. Образование луковицы в области инъекции свидетельствует о хорошей инъекции. Затем оставьте иглу на месте на 3 с, прежде чем аккуратно извлечь иглу. Удержание иглы на месте в течение 3 с сводит к минимуму обратный ток клеток из нерва.
    заметка: Инъекция может быть выполнена в направлении дистального нерва или спинного мозга. Важно оставаться последовательным в рамках серии экспериментов. Если клетки выплеснулись наружу, животное не следует включать в анализ эксперимента. По опыту, такие события очень редки.
11. Верните нерв в исходное положение. Прикройте нерв с вышележащими мышцами. Обработайте мышей с помощью надлежащей анальгезии, а затем закройте кожу нейлоновыми швами 5-0
.
12. Поместите мышь одну в чистую клетку для наблюдения во время восстановления, пока она полностью не придет в себя от анестезии.
    заметка: Животному требуется 5–15 минут, чтобы прийти в полное сознание. Животное не оставляют без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Животное не возвращается в компанию других животных до полного выздоровления. После этого оценивайте восстановление не реже одного раза в 24 часа в течение 72 часов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
мышь			Количество и возраст варьируются в зависимости от экспериментальных потребностей
электробритва	ВАЛЬ	9962	Может быть заменен коммерческим средством для удаления волос
Изофлуран, 250 мл	Бакстер	1001936060
Гипоаллергенная хирургическая лента	Блендерм 3М	70200419342
Бетадин Свит-Стики	ПДИ	Арт.No: 41350
Алкогольные препараты Webcol	Ковидьен	5110
Стерильные хирургические инструменты (ножницы и щипцы)
10 μл шприца Hamilton	Гамильтон	80308
Стальной микрошпатель	Научный центр Фишера	С50823
Препарирующий микроскоп
Бупивацин, 1 г	Энцо Медико-Биологические Науки	БМЛ-НА139-0001	Восстановите до 0,5%
5-0 Нейлоновый шов	Этикон	698Ч