$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Извлечение седалищного нерва
- Возьмем мышей, в седалищные нервы которых ранее были введены раковые клетки, и усыпим их CO2. Поместите мышь на ее вентральную сторону и стабилизируйте дистальные конечности с помощью булавок.
- Удалите кожу с тыльной стороны инъекционной конечности и туловища.
- Используя тупое рассечение, обнажите седалищный нерв вглубь мышц.
- Нерв проходит между подвздошной костью и крестцом. Чтобы иметь доступ к нерву в области спинного мозга, разделите две кости. Сначала вставьте закрытые ножницы в узкий участок, где находится седалищный нерв, а затем откройте ножницы, держа мышь. Будьте деликатными и сохраняйте целостность седалищного нерва во время рассечения.
- Осторожно рассеките седалищный нерв дистально до конца бедренной кости и проксимально до спинного мозга.
заметка: Пораженные нервы чрезвычайно хрупки и склонны к разрыву при напряжении или сильном обращении.
- Извлеките нерв, предварительно разрезав его дистальный конец. Осторожно приподнимите нерв, освобождая его от прилегающих тканей. Перережьте нерв на проксимальном конце, как можно ближе к его выходу из позвоночного столба.
- Затем запишите общую длину вторжения с помощью штангенциркуля. Эта макроскопическая оценка носит лишь ориентировочный характер.
2. Обработка нервов и количественная оценка
- Встроить рассеченный нерв в ОКТ-соединение. Убедитесь, что нервы расположены продольно и как можно ровнее на дне формы.
- Укажите на кассете проксимальную и дистальную сторону нерва, отметив буквы P (проксимальный) и D (дистальный).
- Поместите вложенные нервы поверх сухого льда, если они не разрезаны сразу. Образец может храниться при температуре -80 °C в течение нескольких недель.
- Разрезы образцов с помощью микротома Cryostat толщиной 5 мкм и размещение срезов на стеклянных предметных стеклах. По возможности установите два нервных среза на предметное стекло. Укажите проксимальную сторону нерва.
- Окрашивайте предметные стекла с помощью окрашивания H&E.
- Сканируйте окрашенные участки нерва в цифровом виде с помощью сканера предметных стекол, который предоставляет цифровые данные с высоким разрешением.
- Используя программное обеспечение для обработки изображений, количественно оцените продолжительность инвазии, нажав кнопку «Измерить расстояние», площадь инвазии или другие желаемые параметры. Для хорошей оценки продолжительности инвазии используйте несколько участков (от 2 до 4) одного и того же нерва.