$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка мышей к инъекции опухолевых клеток
- Обезболите мышь путем внутрибрюшинного (в/в) введения коктейля кетамин/ксилазин (кетамин 100 мг/кг, ксилазин 10 мг/кг).
- Подтвердите полную анестезию, ущипнув животное за ноги и наблюдайте за отсутствием реакции.
- Поместите мышь на стеклянную пластину (используется для литья белковых гелей) и закрепите резинками.
- При необходимости удалите волосы на шее, побрив или нанеся небольшое количество средства для эпиляции и вытерев волосы бумажным полотенцем.
заметка: Если вы используете голых мышей, пропустите этот шаг, так как у них нет волос на теле.
- Очистите кожу шеи, применив повидон-йод и 70% спирт.
- Поместите мышь на столик для препарирования микроскопа
- Сделайте разрез на коже длиной ~1 см хирургическим скальпелем.
- Тупо рассеките мышцу зубчатыми щипцами, чтобы обнажить сонную артерию под ней.
- Отделите сонную артерию от соседнего блуждающего нерва с помощью хирургических щипцов.
- С помощью хирургических щипцов отделите немного ваты от ватного тампона, смочите и сформируйте ватный тампон меньшего размера. Поместите этот буферно увлажненный ватный тампон под сонную артерию предполагаемого места инъекции.
- Наложите шов дистальнее и проксимальнее ватного диска и завяжите свободные узлы. Затяните проксимальный узел, чтобы перекрыть приток крови к месту инъекции.
- Приступайте к инъекции раковых клеток, если сонная артерия на ватном шарике оказывается полностью под давлением свежей красной крови.
2. Инъекция раковых клеток в сонную артерию
- Сделайте вихрь и наберите в шприц 100 мкл раковых клеток.
- Под препарирующим микроскопом медленно введите иглу 31G (скосом вверх) в просвет сонной артерии, сидящей поверх ватного тампона.
- Медленно вводите клетки из шприца в сонную артерию. Успешную инъекцию можно наблюдать под микроскопом по изменению цвета близлежащих кровеносных сосудов и мускулатуры, когда буферные раковые клетки проталкиваются в кровоток.
- Когда инъекция всего объема будет завершена, осторожно поднимите дистальный отдел сонной артерии, чтобы предотвратить регургитацию.
- Быстро затяните дистальный узел, чтобы завершить процесс инъекции.
- После завершения инъекции затяните лигатуры и обрежьте излишки шелкового шва микроножницами под рассекающим микроскопом. Отодвиньте отделенную мышцу назад, чтобы покрыть место раны. Закройте кожу двумя скобами.
3. Хирургическое восстановление
- Переместите прооперированное животное на грелку для восстановления. Животным может потребоваться 30–60 минут, чтобы прийти в сознание. В то же время вводите бупренорфин (0,05 мг/кг) через подкожную инъекцию в качестве послеоперационной анальгезии.
заметка: Анальгезия должна проводиться в соответствии с вашим местным протоколом, одобренным IACUC.
- Как только животные проснутся и вернутся к своему обычному поведению, верните мышей на их место обитания. Обеспечьте мышей гелевым кормом в течение нескольких дней после операции. Ведите хирургическую карту и храните ее в комнате.
4. Неинвазивная визуализация in vivo
- Для клеток, меченных люциферазными репортерными конструкциями, измерьте эффективность инъекции раковых клеток с помощью системы визуализации in vivo.
заметка: Визуализация не проводится в день инъекции, чтобы избежать чрезмерного стресса для исследовательских животных.