Долгосрочная ортотопическая трансплантация опухолевых клеток эмбрионам рыбок данио: эффективный метод доставки опухолевых клеток в четвертый желудочек эмбрионов рыбок данио для долгосрочного анализа поведения опухолевых клеток

Аннотация

Источник: Casey, M. J. et al. Трансплантация детских опухолей головного мозга рыбок данио-рерио иммунно-компетентным хозяевам для долгосрочного изучения поведения опухолевых клеток и реакции на лекарства.J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует ортотопическую трансплантацию опухолевых клеток мозга данио-рерио в четвертый желудочек иммунокомпетентного эмбриона данио-рерио. Эта процедура позволяет провести долгосрочное изучение инвазии и поведения опухолевых клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Введение опухолевой суспензии в четвертый желудочек эмбриона с 2-dpf

1. Перенесите 10–20 обезболенных дехорионированных эмбрионов на периферию инъекционной пластины с помощью передаточной пипетки; эмбрионы должны упасть латерально на инъекционную пластину, при этом желудочки должны быть хорошо видны и доступны. С помощью наклонного зонда отрегулируйте эмбрионы по мере необходимости и расположите их подальше от внешнего края инъекционной пластины.
2. Загрузите в иглу 1–2 мкл суспензии опухолевых клеток с помощью наконечников пипеток с загрузкой гелем и введите иглу в манипулятор.
3. Вручную опустите манипулятор, удерживая иглу под углом 45°. Отрегулируйте ручки на микроманипуляторе в направлениях x, y и z, пока игла не окажется чуть выше и примерно в 5 мм справа от головки эмбриона. Посмотрите в окуляры стереомикроскопа и медленно отрегулируйте микроманипулятор в направлении х до тех пор, пока игла не проткнет четвертый желудочек эмбриона. Не допускайте попадания иглы в сердце или желток.
   1. Нажмите на ножную педаль, прикрепленную к микроинъектору, чтобы ввести суспензию опухолевых клеток.
      заметка: Давление и время впрыска будут варьироваться в зависимости от размера отверстия иглы, но хорошей отправной точкой является 5–10 фунтов на квадратный дюйм и 50–100 мс. Объем введенных опухолевых клеток можно оценить с помощью стандартных методов капель масла путем инъекции в минеральное масло, если это необходимо. Инъекции объемом 500 пл с диаметром капли 0,1 мм обычно дают наилучшие результаты.
4. Аккуратно смойте введенные эмбрионы с инъекционной пластины в чашку Петри, используя свежую яичную воду (0,6 г/л аквариумной соли в воде обратного осмоса + 0,01 мг/л метиленового синего). Сохраняйте эмбрионы в яичной воде в течение оставшихся процедур или до тех пор, пока они не будут выращены в резервуарах.
5. Осмотрите введенные эмбрионы под флуоресцентным стереомикроскопом. Подтвердите, что давление инъекции, угол, размер иглы и вязкость клеточной суспензии приводят к тому, что опухолевые клетки заполняют 25–50% пространства желудочка. При необходимости отрегулируйте эти параметры.
6. Повторите шаги 1.1–1.5 для всех оставшихся эмбрионов. При необходимости обезболивайте дополнительные эмбрионы.
   заметка: Опытный пользователь может ввести до 300 эмбрионов в течение 3–4 часов.
7. Поместите эмбрионы обратно в инкубатор с температурой 28°C на ночь.
8. На следующий день оцените выживаемость эмбриона, изучив морфологические и физиологические особенности, такие как нормальное развитие сердца и мозга, как описано.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Яичная вода	В доме		Поддержание эмбрионов, изготовление инъекционной пластины
чашка Петри	Термо Фишер	FB0875711Z	Размещение эмбрионов, изготовление инъекционной пластины
Стеклянная тара	Любой коммерческий бренд		Изготовление инжекторной пластины
Микропипетки	Любой коммерческий бренд		Ресуспензия и трансплантация опухоли
Угловой щуп	Инструменты для точной науки	10140-02	Манипуляции с эмбрионами
Трансферная пипетка	Любой коммерческий бренд		Манипуляции с эмбрионами
Стереомикроскоп	Олимп	СЗ61	Трансплантация опухолей
Флуоресцентный стереомикроскоп	Олимп	СЗХ16	Визуализация трансплантации опухолей
Камера для микроскопа	Олимп	ДП-72	Визуализация трансплантации опухолей
инкубатор	Любой коммерческий бренд		Поддержание эмбрионов, разогрев инъекционной пластины
N2	Любой коммерческий бренд		Для настройки микроинъектора
Стеклянный капилляр (без нити)	Мировые прецизионные приборы	ТВ120-4	Трансплантация опухолей
Съемник игл	Инструменты Саттера	-97	Трансплантация опухолей
Советы по микрозагрузчикам	Эппендорф	930001007	Трансплантация опухолей
Микроинъектор	Гарвардский аппарат	ПЛИ-90	Трансплантация опухолей
Трикаин-С (MS-222)	Вестерн Кемикал	ТРС1	Трансплантация опухолей, обезболивающее
агароза	Денвилл	СА3510-8	Изготовление инжекторной пластины
микроволновый	Любой коммерческий бренд		Изготовление инжекторной пластины
шкала	Любой коммерческий бренд		Изготовление инжекторной пластины
Перчатки	Любой коммерческий бренд		Все аспекты протокола
Проназа	Рош Диагностика	11459643001	Эмбрионы дехорионатных
лезвие	Термо Фишер	12640	Подготовка иглы
Стакан 50 мл (диаметр 2 дюйма)	Любой коммерческий бренд		Изготовление инжекторной пластины
Стеклянная тара	Любой коммерческий бренд		Изготовление инжекторной пластины
Метиленовый синий	Сигма-Олдрич	М9140	Добавьте в воду для яиц, чтобы предотвратить рост грибков