Интраназальная доставка терапевтических нейральных стволовых клеток (НСК) на мышиной модели: процедура нацеленной на опухоль доставки онколитических вирусных НСК в мышиную модель, несущую опухоль головного мозга

Аннотация

Источник: Yu, D. et al. Интраназальная доставка терапевтических стволовых клеток в глиобластому на мышиной модели. J. Vis. Exp.(2017)

Это видео демонстрирует интраназальную доставку терапевтических нейральных стволовых клеток, загруженных онколитическим вирусом, в мышиную модель с опухолью мозга. Неинвазивное интраназальное введение стволовых клеток обходит гематоэнцефалический барьер, облегчая их доставку к месту опухоли в мозге для терапевтического применения.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Гипоксическое прекондиционирование НСК человека (Рисунок 1A)

1. Планшетные культивируемые НСК в колбах с культурой T75 до достижения 90% конфлюенции.
2. Поместите колбы с клеточными культурами в увлажненную камеру/инкубатор с содержанием_CO2 на уровне 1%_O2 в течение 24 ч с помощью подачи газа_N2, контролируемой автоматическим встроенным расходомером. Эти клетки называются ^HNSC. Контрольные ^NNSC генерируются как:
   1. Поддерживайте человеческие НСК (клоны HB1.F3.CD) в среде DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C при 95% воздуха в помещении и 5%_CO2.

2. Загрузка НСК человека онколитическим вирусом (Рисунок 1B-1H)

1. Инфицировать ^NНСК, ^HНСК 50 условными репликативными аденовирусными частицами (CRAd)-S-pk7 вируса.
2. После 2 ч инкубации при комнатной температуре с периодическим простукиванием клетки трижды промыть средами для удаления несвязанных вирусных частиц и суспензировать клетки в стерильном физиологическом растворе для инъекций.
   осторожность: Проводите все связанные с вирусом процедуры культивирования клеток in vitro в учреждениях с соответствующим уровнем биобезопасности, таким как BSL2. Исследователи, работающие с онколитическим вирусом, должны носить соответствующие средства индивидуальной защиты в соответствии с рекомендациями учреждения для животных.

3. Интраназальная доставка терапевтических НСК (рисунки 1D и рисунок 2D)

1. Культивирование и сбор НСК (^NНСК, ^НБК).
2. Обезболивание мышей путем внутримышечного введения смеси кетамина и ксилазина в соответствии с методикой:
   1. Обезболить животное в зависимости от массы тела с использованием одобренных реагентов, т.е. либо путем внутрибрюшинного (в/в) введения смеси кетамина (50–100 мг/кг; обратитесь к институциональному IACUC за утвержденным диапазоном доз) и ксилазина (5–10 мг/кг; обратитесь к институциональному IACUC за утвержденным диапазоном доз) в 200–250 мкл стерильного физиологического раствора, или с помощью 4–5% изофлурановой анестезии с помощью ингаляционного устройства.
3. Поместите мышей на чистую простыню лицевой стороной вверх, а под ней грелку, чтобы поддерживать температуру тела. Отрегулируйте мягкую подушку из свернутых бумажных полотенец с лентами, чтобы обеспечить вертикальный угол ноздрей при размещении под головкой мыши.
4. С помощью микропипетки нанесите 2 мкл суспензии NSC в каждую ноздрю мыши. Визуально подтвердите аспирацию капли перед переходом к следующей мыши. Общее количество доставляемых ячеек может быть определено пользователем; использовать 62 500–125 000 клеток/мкл, так что 0,5–1 миллион клеток могут быть доставлены в 4 дозах по 2 мкл.
5. Используйте таймер, чтобы обеспечить 5-минутный интервал между каждым введением клеточной суспензии, до 4 раз.
6. Позвольте животным восстановить подвижность в восстановительной камере, сохраняя лежачее положение на спине на протяжении всего времени.

Результаты

Рисунок 1: Блок-схема общих процедур подготовки стволовых клеток, предшествующих интраназальному введению. (А–В) Гипоксическая предварительная обработка или генетическая модификация стволовых клеток для сверхэкспрессии CXCR4. (Б–Г) Для последующей загрузки стволовых клеток терапевтическим или диагностическим грузом выполняются этапы промывки, ферментативной диссоциац...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Материалы для клеточных культур (пластмассы)	ThermoFisher Scientific	Меняется	Возможность замены с любым источником
Охлаждаемая микроцентрифуга Legend Micro 21R	ThermoFisher Scientific	75002490	Возможность замены с любым источником
Настольная центрифуга Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Возможность замены с любым источником