Генерация микроопухолей: метод культивирования in vitro для культивирования 3D-микроопухолей для анализа реакции на медикаментозное лечение

Аннотация

Источник: Gilbert, A. N. et al. Генерация микроопухолей с использованием 3D биогелевой системы человека и клеток глиобластомы, полученных от пациента, для киномического профилирования и тестирования реакции на лекарственные препараты. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео мы создаем микроопухоли из опухолевых клеток, полученных от пациента, с помощью 3D человеческого биогеля. Эти микроопухоли очень похожи на микроокружение опухоли in vivo и служат потенциальными платформами для тестирования лекарств.

Протокол

1. Генерация микроопухолей

1. Приготовление реагентов
   1. Приготовьте полный НБМ, добавив следующее в один флакон 500 мл нейробазальной среды (НБМ) для приготовления полного НБМ: 10 мл добавки B-27 без витамина А, 5 мл добавки N2, 100 мкл EGF, 100 мкл фактора роста фибробластов (FGF)-Basic, 5 мл амфотерицина B, 0,5 мл гентамицина, 5 мл L-глутамина и приготовьте нейтрализованный человеческий биогель высокой плотности (HuBiogel) (HDHG в дозе 3 мг/мл) в соответствии с внутренним протоколом. Можно использовать и подобные биогелевые матрицы.
2. Производство и культивирование микроопухолей
   1. Получить свежедиссоциированные PDX-клетки в виде одиночной клеточной суспензии в полном НБМ, на льду.
   2. Смешайте клеточную суспензию с равным объемом раствора трипанового синего (0,4% в PBS) и проанализируйте с помощью гемоцитометра для определения количества клеток и жизнеспособности путем исключения трипанового синего. Удалите объем, необходимый для генерации 50 000 клеток/микроопухоли, где объем = (50 000 клеток/опухоль * # опухолей)/(количество жизнеспособных клеток / 1 мл) и поместите в свежую коническую пробирку.
   3. Сконцентрируйте ячейки центрифугированием при 150 x g в течение 8 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу ледяным раствором HDHG в конечном соотношении 1 часть клеток в FBS и 4 части HDHG.
   4. С помощью электронной многоканальной дозатора подайте смесь 10 μL per pin cell-HDHG на 96-контактную стальную пластину (с гидрофобным покрытием) для создания микроопухолей (шарики 2 мм, каждая из которых содержат 50 000 клеток).
   5. Поместите 3D шарики опухолей в инкубатор для культуры тканей (37 °C, 5% CO₂, увлажненный) на 15 минут для желатинирования шариков.
   6. После гелеобразования перенесите микроопухоли (10 мкл) в специальную камеру для культивирования суспензии (50 мл) или большую объемную чашку для культивирования (10 см), содержащую полный НБМ, с помощью электронной многоканальной пипетки и специального штифтового устройства.
   7. После 1–2 дней в инкубаторе для тканевых культур перенесите микроопухоли в 96-луночные планшеты, содержащие 50 мкл NBM/лунку, с помощью дозирующей пипетки с широким горлышком и выполните различные протоколы анализа и анализа.
3. Медикаментозное лечение и поддержание микроопухолей
   1. Выберите концентрации для тестирования на наркотики.
      Примечание: Если препарат имеет известную эффективность в 2D-культуре, выберите 2-кратную концентрацию IC50 в качестве средней концентрации и выберите 3-кратные серийные разведения выше и ниже, чтобы в общей сложности получить 5 уровней дозы. Например, если IC50 составляет 9 мкМ для лекарственного препарата в 2D-культуре, выберите 2 мкМ, 6 мкМ, 18 мкМ, 54 мкМ и 162 мкМ в качестве конечной концентрации для тестирования лекарственного средства.
   2. Приготовьте 2x дозирующий раствор препарата в полном НБМ из запаса диметилсульфоксида (ДМСО). Развести дозирующий раствор в 1% среде ДМСО для приготовления 5 доз, 3-кратного серийного разведения.
   3. Добавьте 50 мкл дозирующего раствора в лунку для микроопухолей, содержащую 50 мкл в аналитических планшетах, для достижения конечной концентрации ДМСО 0,5%. Повторите для каждой реплики (например, 4) при каждой дозе препарата, определенной на шаге 1.3.1.
   4. Выдерживать культуры при температуре 37 °C, 5% CO₂, в инкубаторе для увлажненных культур тканей в течение 1–14 дней. Подкармливайте культуры два раза в неделю освежающей средой и раствором препарата, как указано выше.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коллагеназа-I	Сигма-Олдрич	СО130
Нейробазал-А	Технологии Life	10888-022
Дополнение N-2	Технологии Life	17502-048	1x финальная концентрация
Добавка B-27 без витамина А	Технологии Life	12587-010	1x финальная концентрация
Рекомбинантный человеческий FGF-базовый	Технологии Life	PHG0266	Конечная концентрация 10 нг/мл
L-глютамин	Корнинг Селлгро Медиатек	25-005-КИ	Конечная концентрация 2 мМ
Гентамицин	Технологии Life	15750-060	Конечная концентрация 50 нг/мл
Трипан синий	Пирс ТермоСайентиал	15250-061
Губиогель высокой плотности	Компания Vivo Biosciences	ХРТГ-5
Дмсо	рыбак	БП231	Для растворения кальцеина AM и компаундов
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко с Ca/Mg	Корнинг Селлгро Медиатек	20-030-CV	Разбавлен до 1x сверхчистой водой MiliQ (для предварительной фиксации стирки)
10% нейтральный буферизованный формалин	протокол	032-060 (Английский)
Стеклянные чашки Петри 100 мм	рыбак	08-748Д