Методическая статья

Индукция глиобластомы с использованием SB-опосредованной транспозиции: метод создания новой модели мыши с использованием транспозон-опосредованной интеграции SB-плазмиды в мозг неонатальной мыши

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Калинеску, А. А. и др. Транспозонопосредованная интеграция плазмидной ДНК в субвентрикулярную зону новорожденных мышей для создания новых моделей глиобластомы. J. vis. Exp. (2015)

Это видео описывает эффективную технику индуцирования глиобластом (ГБМ) с использованием транспозонной ДНК, вводимой в желудочки новорожденных мышей. Клетки субвентрикулярной зоны, которые поглощают плазмиду, трансформируются, пролиферируют и порождают опухоли с гистопатологическими характеристиками ГБМ человека.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Внутрижелудочковые неонатальные инъекции

  1. За три-четыре недели до эксперимента установите клетку для разведения мышей с одним самцом и одной самкой мыши, а также пластиковое цветное иглу. Это обеспечивает обогащенную среду и способствует процессу спаривания.
  2. Когда беременность подтвердится, отсадите самца в новую клетку. Через восемнадцать дней после вязки ежедневно следите за клеткой для родов. Выполняйте внутрижелудочковые инъекции на 1-й день после рождения (P1).
  3. Приготовление раствора для инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для инъекций получают путем смешивания плазмидной ДНК с реагентом для трансфекции для создания частиц для трансфекции. Ниже приведен пример по приготовлению инъекционного раствора с использованием плазмиды, кодирующей транспозазу и люциферазу Спящей красавицы: pT2/SB100x-Luc и двух транспозонных плазмид: pT/CAGGS-NRASV12 и pT/CMV-SV40-LgT, в соотношении 1:2:2. Все плазмиды имеют концентрацию 2 г/л.
    1. Приготовьте раствор ДНК путем добавления: 4 г (2 мкл) pT2/SB100x-Luc, 8 мкг (4 мкл) pT/CAGGS-NRASV12 и 8 г (4 мкл) pT/CMV-SV40-LgT и 10 мкл 10% глюкозы до конечного объема 20 мкл при концентрации 1 мкг/мл ДНК и 5% глюкозы.
    2. Приготовьте раствор PEI, добавив 2,8 мкл in vivo jet PEI, 7,2 мкл стерильной воды и 10 мкл 10% глюкозы до конечной концентрации 5% глюкозы.
    3. Добавьте раствор PEI к раствору ДНК, перемешайте и оставьте при комнатной температуре (RT) на 20 минут. Теперь раствор готов к инъекции. Через час после сеанса RT держите раствор на льду.
    4. Установите в микронасос чистый шприц объемом 10 μл, оснащенный иглой для подкожных инъекций 30G со скосом 12,5° (рис. 1 #1).
  4. Чтобы убедиться в правильности функционирования системы инъекций, с помощью автоматического инжектора (Рисунок 1 #1) наберите 10 мкл воды в шприц, а затем полностью опорожните шприц.
  5. Охладите неонатальную стереотаксическую стадию (рис. 1 #3) с помощью суспензии из сухого льда и спирта до температуры 2–8°С.
  6. Индуцируйте анестезию, поместив щенков на влажный лед на 2 мин. Анестезия будет продолжаться на охлажденной стереотаксической раме до конца процедуры. Поддержание температуры рамы выше нуля, в пределах 2–8 °C, предотвратит термические ожоги. В качестве особой меры предосторожности щенков можно завернуть в марлю перед помещением на мокрый лед.
  7. Наполните шприц раствором ДНК/ПЭИ.
  8. Обездвижите щенка в стереотаксической раме, поместив его голову между покрытыми марлей ушными планками (рис. 1b). Убедитесь, что спинная сторона черепа расположена горизонтально, параллельно поверхности каркаса и что черепные швы хорошо видны. Протрите голову 70% этанолом.
  9. Опустите иглу шприца и отрегулируйте стереотаксические координаты с помощью циферблатов стереотаксической рамки до тех пор, пока игла не коснется лямбды (пересечения срединной линии теменной и затылочной костей) (рисунок 1b).
  10. Поднимите иглу и отрегулируйте стереотаксические координаты на 0,8 мм латерально и 1,5 мм ростраль от лямбды (рис. 1b).
  11. Опускайте иглу до тех пор, пока она не коснется и слегка углубится в кожу. Измерьте координаты. Опустите иглу еще на 1,5 мм. Игла пронзает кожу и череп и проходит через кору головного мозга, чтобы попасть в боковой желудочек (рисунок 1c).
  12. С помощью автоматического инжектора введите 0,75 мкл раствора ДНК/ПЭИ со скоростью 0,5 мкл/мин.
  13. Подержите щенка на раме еще минуту, чтобы раствор смог разойтись по желудочкам. Тем временем обезболите еще одного щенка, на льду в течение 2 минут, готовясь к следующей инъекции.
  14. Осторожно и медленно поднимите иглу и поместите щенка под нагревательную лампу. Следите за дыханием и активностью. При необходимости обеспечьте мягкую стимуляцию конечностей до тех пор, пока не заследует первое дыхание.
  15. Возвращайте щенка матери после того, как он разогреется, приобретет розовый цвет, будет дышать ровно и активен, обычно 5–7 минут. Если одновременно вводится более одного щенка, держите всех щенков вместе, пока не будут сделаны все инъекции. Если инъекции длятся дольше 30 минут, верните половину щенков через первые 30 минут, а остальных в конце процедуры.
  16. Следите за тем, чтобы самка была отзывчивой и заботливой по отношению к своим щенкам. При необходимости добавьте в клетку суррогатную маму.
  17. Следите за тем, чтобы интервал между помещением щенка на лед и помещением его под лампу для обогрева составлял менее 10 минут. Чем быстрее процедура, тем лучше приживаемость. Обычно время, необходимое для обезболивания и инъекции щенка, составляет 4 минуты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальная установка и руководства для внутрижелудочковых инъекций у неонатальных мышей. (а)Стереотаксическая рама (2) с микрометрическими циферблатами оснащена автоматическим инжектором, удерживающим шприц объемом 10 мкл (4). Внутри U-образной рамы надежно закреплена неонатальная рамка-адаптер (3). Панель управления автоматического инъектора (1) позволяет точно выб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лабораторный стандарт Stoelting с адаптерами для крыс и мышейСтоелтинг51670Другие компании выпускают подобные рамки, подойдет любая из них с небольшими адаптерами для мыши
Квинтэссенция стереотаксического инжектора (QSI)СтоелтингNo 53311Инъекции могут быть сделаны без него, но автоматический инжектор обеспечивает повышенную воспроизводимость и удобство
Ручной шприц MICROLITER серии 10 μL 700ГамильтонМодель 701Данная модель шприца надежно подает от 0,5 до 500 мкл раствора. Можно также использовать другие шприцы (например, 5 μL, модель 75)
Игла для подкожных инъекций 30 калибра (1,25", 15^{o} фаска)ГамильтонS/O# 197462Эта игла идеально подходит для прокалывания кожи и черепа неонатальной мыши без необходимости других инвазивных процедур. Если он тускнеет (плохо проникает в кожу), его необходимо заменить.
In vivo jet PEIПолиплюс Трансфекшн201-10ГАликвоту в небольших объемах и держать при -20ºC
D-люциферин, калийная сольGoldbio.comЛакК-1гДругие источники люцифиеразы светлячков столь же адекватны
Раствор гематоксилина, Harris ModifiedСигма ОлдричHHS128-4L

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SB

Похожие статьи