$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Вскрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные условия не требуются, если только сосуды не используются для культивирования клеток. Приготовьте растворы для изоляционных сосудов: В1, добавьте 1,5 мл HEPES 1M к 150 мл HBSS; В2, добавить 3,6 г декстрана к 20 мл В1; В3, добавьте 1 г БСА к 100 мл В1.
- Приготовьте стакан объемом 150 мл с 20 мл B1. Держать на льду и накрыть парапленкой во избежание загрязнения воздуха.
- Глубоко обезболите мышь под капюшоном небольшим бумажным полотенцем, смоченным в 1 мл чистого изофлурана, который добавляют в клетку. Обезболивание верифицируется отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Убить мышь при вывихе шейки матки.
заметка: Эти шаги выполняются в соответствии с национальными и институциональными нормами.
- Необязательно: Выполните внутрисердечную перфузию с 20 мл PBS 1x для устранения содержания крови.
- Разрежьте кожу скальпелем от шеи до носа и оттяните ее. Удалите все загрязняющие волоски с помощью PBS 1x.
- Чтобы открыть череп, сначала вставьте ножницы спереди от обонятельной луковицы, а затем откройте ножницы, чтобы разорвать череп на две части.
- Аккуратно удалите мозг с помощью мозгового шпателя. Отделите сосудистое сплетение от боковых желудочков, так как они могут загрязнить препарат кровеносных сосудов.
заметка: Дополнительно: Окончательный препарат будет содержать паренхиматозные сосуды и сосуды мозговых оболочек. При нежелании мозговые оболочки можно отшелушить.
- Перенесите мозг в стакан, содержащий раствор B1 на льду. Одновременно можно лечить до 8 головных мозгов.
2. Гомогенизация тканей мозга
- С помощью двух скальпелей вручную и энергично вбить мозг в раствор В1, впоследствии получая небольшие кусочки размером около 2 мм.
- Гомогенизируйте препарат с помощью автоматизированного гомогенизатора Dounce, выполняя 20 ходов при 400 об/мин. Убедитесь, что стеклянная трубка находится во льду и что верхняя часть наконечника находится в растворе при движении вверх и вниз, чтобы предотвратить образование воздушных карманов. Если подготовлено несколько образцов, промойте шезлонг ионизированной водой между каждой гомогенизацией.
3. Очистка сосудов
- Перелейте гомогенат в пластиковую пробирку объемом 50 мл и приступайте к центрифугированию при температуре 2 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. На верхней части сосуда образуется большая белая граница раздела (в основном миелин) (красная, если перфузия не проводилась).
- Выбросьте надосадочную жидкость. Гранула сосуда и белая граница раздела останутся прикрепленными друг к другу. Добавьте 20 мл ледяного раствора B2 и энергично встряхивайте пробирку вручную в течение 1 минуты.
- Приступайте ко второму центрифугированию при 4 400 x g в течение 15 минут при 4 °C. Теперь миелин образует плотный белый слой на поверхности надосадочной жидкости.
- Осторожно отделите слой миелина от стенок трубки, удерживая трубку и медленно вращая ее, чтобы надосадочная жидкость могла пройти вдоль стенок. Выбросьте миелин вместе с надосадочной жидкостью. Гранула, содержащая сосуды, остается прикрепленной на дне пробирки.
- Промокните внутреннюю стенку пробирки абсорбирующей бумагой, обернутой вокруг пластиковой пипетки объемом 5 мл, и удалите все остатки жидкости, не прикасаясь к сосуду с гранулой. Держите трубку вверх дном на впитывающей бумаге, чтобы стекла оставшаяся жидкость.
- Суспензируйте гранулу в 1 мл ледяного раствора В3 путем пипетирования вверх и вниз с помощью наконечников с низким связыванием, удерживая трубку на льду, затем добавьте еще 5 мл раствора В3. Следите за тем, чтобы сосуды были максимально рассредоточены и не образовывали агрегатов.
4. Фильтрация
- Приготовьте стакан на льду с 30 мл ледяного раствора В3. Накройте парапленкой во избежание загрязнения воздуха.
- Поместите фильтр размером 20 мкм на модифицированный фильтродержатель в верхней части колбы Беккера и уравновесьте его, нанеся 10 мл ледяного раствора B3.
- Налейте сосуд на фильтр и промойте сосуды 40 мл ледяного раствора В3.
- Восстановите фильтр с помощью чистых щипцов и немедленно погрузите его в стакан с раствором B3. Отсоедините сосуды от фильтра, слегка встряхнув его.
- Высыпьте содержимое стакана в пластиковую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при температуре 2 000 x g в течение 5 минут при температуре 4°C.
заметка: В качестве альтернативы, суспензия сосудов головного мозга из стадии 3.6 может быть отфильтрована на фильтре с ячейками 100 мкм. В этом случае более крупные сосуды преимущественно задерживаются на фильтре, в то время как проточный канал содержит микрососуды (в основном капилляры), которые затем фильтруются на фильтре с ячейками 20 мкм, как указано выше.
- Суспендируйте гранулу микрососудов в 1 мл ледяного раствора B3 и перенесите ее пипетированием в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при давлении 2 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.