Анализ фагоцитоза in vitro: метод на основе визуализации в реальном времени для изучения фагоцитоза синаптосомы астроцитов, опосредованного астроцитами

Аннотация

Источник: Byun, Y. G., Chung, W. S. Новый in vitro анализ астроцитарно-опосредованного фагоцитоза в реальном времени с использованием конъюгированных с индикатором pH синаптосом. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы оцениваем фагоцитарную способность очищенных астроцитов in vitro с помощью анализа визуализации в реальном времени. Анализ служит эффективной платформой для скрининга для выявления химических соединений, которые могут усиливать или подавлять фагоцитарную способность астроцитов.

Протокол

1. Анализ фагоцитоза в реальном времени (Рисунок 1)

1. Подготовьте 24-луночный планшет (или любую тарелку/чашку, подготовленную для визуализации в реальном времени), в котором астроциты сливаются (как правило, от 7 до 10 дней инкубации после очистки идеально подходят для стабилизации клеток).
2. Удалите фильтрующий материал из каждой лунки и промойте лунки 1 мл фосфатного буферного раствора Дульбекко (DPBS) три раза. Чтобы свести к минимуму воздействие воздуха, быстро промойте лунки.
3. Добавьте 300 мкл иммунопанированных основных сред астроцитов (IP-ABM) с 5 мкл синаптосом, конъюгированных с индикатором pH, и дополнительными факторами, такими как иммунопанированная среда, кондиционированная астроцитами (IP-ACM), которые могут модулировать фагоцитоз глиальных клеток.
4. Инкубируйте планшет в инкубаторе с_CO2 в течение 40 минут. Этот этап позволяет синаптосомам, конъюгированным с индикатором pH, оседать на дно пластин.
5. Удалите среды с несвязанными синаптосомами, конъюгированными с индикатором pH, и промойте каждую лунку 1 мл DPBS три раза.
   осторожность: Не стирайте сильно. Чтобы свести к минимуму воздействие воздуха, быстро промойте лунки.
6. Добавьте в скважины 500 μл IP-ABM с дополнительными факторами для испытаний.
7. Поднесите пластину к прибору для визуализации в реальном времени и выберите положение. Отрегулируйте фокусировку, время экспозиции, яркость и мощность светодиодов.
   заметка: Настройки времени экспозиции, яркости и мощности светодиода варьируются в зависимости от интенсивности флуоресценции и цели эксперимента. В анализе визуализации в реальном времени с синаптосомами, конъюгированными с индикатором pH, мы обычно устанавливаем эти значения следующим образом: экспозиция: ~150–200 мс, яркость: 15 и мощность светодиода: 4–6.
8. Задайте формат изображения, временной интервал и общее количество циклов для создания изображений в реальном времени. Установите временной интервал на 1 или 2 часа в зависимости от того, сколько позиций выбрано. Интервалы в 2 часа рекомендуются, когда выбрано более 150 позиций для визуализации в реальном времени.
9. Начните эксперименты с визуализацией в реальном времени.

Результаты

Рисунок 1. Схема анализа фагоцитоза в режиме реального времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
pHrodo красный, сукцинимидиловый эфир	Зонды молекулы	П36600	Для конъюгации индикатора pH
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	16000-044
DMEM	Gibco	11960-044
dPBS	Велгене	ЛБ001-02
Анализ фагоцитоза в реальном времени
Сцена Джули	НаноЭнтек
Подключаемые модули Time Series Analyzer V3	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html