Ex vivo электропорация срезов мозжечка куриного эмбриона: метод введения плазмидной ДНК, кодирующей зеленый флуоресцентный белок, для визуализации зернистого развития клеток

Аннотация

Источник: Hanzel, M. et al.ex vivo культура ломтиков мозжечка цыплят и пространственно направленная электропорация предшественников гранулярных клеток.J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы выполняем электропорацию срезов мозжечка куриного эмбриона с помощью плазмид репортерного гена. Этот метод облегчает визуализацию развития и миграции предшественников гранулярных клеток с образованием зернистого слоя.

Протокол

1. Электропорация ломтиков

1. Сконструируйте камеру электропорации, закрепив анод электропоратора к основанию чашки Петри диаметром 60 мм с помощью изоляционной ленты. Добавьте примерно 1 мл HBSS, чтобы покрыть электрод.
2. Поместите культуральную вставку 0,4 мкм поверх электрода, покрытого HBSS. Дайте вставке для культуры уложиться на электрод, убедившись, что между вставкой и электродом всегда есть контакт.
   заметка: В этой конфигурации культуральная вставка со срезами будет опираться на поверхность раствора, сохраняя контур, но допуская пространственное нацеливание катода.
3. Перенесите идентифицированные срезы (до пяти на вкладыш для культуры) на вкладыш для культивирования с помощью пипетки Пастера объемом 3 мл с отрезанным наконечником. Отделите и дайте осесть на культуре вставки в сагиттальной ориентации.
4. С помощью пипетки удалите излишки HBSS, чтобы срезы больше не купались в растворе.
5. С помощью наконечника для дозатора P10 ДНК пипетки (в концентрации 1 г/мкл) разбавляют 20% быстрым зеленым цветом на поверхности целевого участка среза. 20% быстрого зеленого цвета обеспечивают вязкий раствор ДНК и предотвращают непомерно широкое рассеивание ДНК. Добавьте примерно 5 мкл ДНК/быстрый зеленый раствор в каждый срез (рис. 1B).
6. Поместите катод на желаемую целевую ткань и электропорируйте импульсами 3 x 10 В длительностью 10 мс. Избегайте прямого контакта катода с тканью. Вместо этого используйте поверхностное натяжение жидкости для поддержания проводимости (поместите катод как можно ближе к ткани, фактически не касаясь ткани).
7. Повторите доставку ДНК и электропорацию в несколько областей EGL на каждом отдельном срезе мозжечка по желанию.
8. По окончании электропорации переложите культуральный вкладыш в чашку Петри 30 мм.
9. К каждой культуре добавьте 1 мл предварительно подогретой питательной среды (Basal Medium Eagle, 0,5% (w/v) D-(+)-глюкозы, 1% добавки B27, 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина) под культуральный вкладыш таким образом, чтобы культуральный вкладыш контактировал со средой, но срезы не купались в ней.
10. Инкубируйте культуры при 37 °C/6%_CO2 в течение 3 дней. Заменяйте всю питательную среду каждые 24 часа свежей предварительно подогретой средой.
11. После культивирования зафиксируйте срезы на культуральных вкладышах в течение 1 часа в 4% параформальдегиде (или O/N при 4 °C) в свежей чашке диаметром 30 мм без питательных сред.

Результаты

Рисунок 1. Установка камеры электропорации. (А) Фотография камеры электропорации, изготовленной на заказ. Камера состоит из анода электропоратора, надежно размещенного на основании чашки Петри диаметром 60 мм. Чашка содержит примерно 1 мл HBSS для покрытия электрода. Культуральная вставка должна опираться на электрод с постоянным контактом между вставкой и электродом...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Базальный средний орел (Gibco)	Технологии Life	41010-026
L-глютамин	сигма	Г7513
Пенициллин/стрептомицин	сигма	П4333
Культуральный вкладыш 0,4 мкм	Многородность	PICM0RG50
TSS20 Электропоратор Оводин	Интрасел	Тел.: 01-916-02	Используйте 3 импульса 10 В 10 мс для электропорации.