$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Вскрытие мозжечка и подготовка срезов (время работы ≈ 15–20 минут на животное)
- Поместите одну из 60-миллиметровых тарелок для клеточных культур, содержащую среду для ледяного вскрытия, под бинокулярный микроскоп и снимите верхнюю пластину.
- Промокните мех головы 70% этанолом (тщательно избегая прикосновения к глазам животного) и обезглавьте животное большими острыми ножницами, согласно утвержденной процедуре><.
Примечание: Срезы мозжечка получены от мышей P9-P10 без какого-либо специфического пола или деформационного смещения.
- С помощью маленьких ножниц разрежьте кожу по средней линии головы, начиная от шеи и поднимаясь вверх к мышиной морде.
- Чтобы удержать голову и обнажить череп, отогните кожу вентрально под головой и зажмите две складки кожи между пальцами.
- Аккуратно вставьте маленькие ножницы в большое затылочное отверстие и разрежьте череп, сделав один боковой надрез сбоку, а затем разрежьте весь череп вокруг головы. Во время резки кончик ножниц должен быть как можно ближе и ближе к черепу, чтобы не повредить ткани мозга.
- Извлеките тыльную часть черепа с помощью тонких прямых щипцов. Осторожно поднимая дорсальную часть черепа, при необходимости разрежьте прилипшие мозговые оболочки (полупрозрачную орошаемую мембрану, окружающую ткань мозга) маленькими ножницами, чтобы не повредить ткань мозга.
- Осторожно введите тонкие прямые щипцы (или используйте шпатель) между вентральным черепом и мозгом, аккуратно выверните мозг и перережьте зрительный и тройничный нервы маленькими ножницами.
- Помогите мозгу под действием силы тяжести опуститься в 60-миллиметровую чашку для клеточных культур, содержащую среду для ледяного препарирования, перевернув голову вверх ногами прямо над чашкой, и при необходимости освободите последние спайки маленькими ножницами.
- С помощью тонких щипцов ориентируйте мозг так, чтобы тыльная сторона была обращена к исследователю, а вентральная сторона лежала на дне чашки.
- Под бинокулярным микроскопом с помощью тонких прямых щипцов иммобилизуйте мозг со стороны переднего мозга и избегайте прикосновения к заднему мозгу, так как он может быть поврежден. Отделите задний мозг от остальной части мозга (переднего и среднего мозга, см. схему на рисунке 1Aa) с помощью тонких прямых щипцов. Чтобы отделить мозжечок от остальной части заднего мозга, с помощью тонких щипцов разрежьте ножки мозжечка под мозжечком (см. схему на рисунке 1Aa').
- После того, как мозжечок изолирован, осторожно оторвите мозговые оболочки с помощью тонких прямых щипцов (см. схему на рисунке 1Aa).
- Осторожно удерживайте мозжечок тонкими изогнутыми щипцами и поместите его тыльной стороной вверх на пластиковую платформу перпендикулярно лезвию бритвы измельчителя (см. схему на рисунке 1Bb).
- Отсасывайте избыток диссекционной среды вокруг мозжечка с помощью стерильного наконечника пипетки с тонким концом, адаптированного к пипетке объемом 1 мл (см. схему на рисунке 1Bb).
- Убедитесь, что мозжечок лежит ровно, но не растягивается после размещения на платформе, чтобы получить оптимальные сагиттальные срезы во время разрезания (см. схему на рисунке 1Bb).
- Разрежьте сагиттальные срезы мозжечка толщиной 300 мкм с помощью тканевого прерывателя (см. схему на рисунке 1Bb). Усилие и скорость отвала должны быть оптимизированы на месте.
- Аккуратно нанесите каплю рассекающего средства на разрезанный мозжечок. С помощью наконечника пипетки с широким отверстием, помещенного на пипетку объемом 1 мл, медленно аспирируйте срезанный мозжечок и перенесите его обратно в 60-миллиметровую чашку для клеточной культуры, содержащую среду для ледяного рассечения (см. схему на рисунке 1BB).
- Очищайте пластиковую платформу измельчителя салфеток 100% этанолом между каждым срезом мозжечка. Дайте этанолу испариться, прежде чем поместить следующий мозжечок на платформу.
- С помощью двух тонких прямых щипцов (или титановых игл) разделите отдельные срезы и выберите 6–8 срезов из червей (см. схему на рисунках 1Cc и 1Cc').
- Возьмите 6-луночный планшет с культуральными вставками и перенесите до 4 выбранных срезов на одну культуральную вставку вместе с некоторой средой для рассечения с помощью наконечника для пипетки с широким отверстием, адаптированного к пипетке объемом 1 мл (см. схему на рисунке 1CC).
- Поместите срезы в середину вкладыша для культивирования с помощью среды для рассечения или щипцов, чтобы осторожно надавить и потянуть их в нужное место, избегая их соприкосновения друг с другом (см. схему на рисунке 1Cc).
- Удалите излишки рассекающей среды вокруг ломтиков с помощью наконечника пипетки с тонким концом. Убедитесь, что срезы лежат ровно на мембране (см. схему на рисунке 1Cc).
- Поместите 6-луночную пластину в инкубатор сразу после добавления ломтиков на мембрану.
