Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка культуры ломтиков
- Готовят органотипические культуры среза гиппокампа мышей с использованием постнатальных мышей в возрасте от 6 до 7 дней обоего пола.
- Приготовьте среду для вскрытия органотипической культуры срезов, состоящую из (в мМ): 238 сахарозы, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 12PO4 и 11 глюкозы в деионизированной воде, затем газообразный с 5% CO2/95% O2 до pH 7,4.
- Готовят органотипические среды для срезов, состоящие из: 78,8% (v/v) минимально незаменимой среды Eagle, 20% (v/v) лошадиной сыворотки, 17,9 мМ NaHCO3, 26,6 мМ глюкозы, 2 М CaCl2, 2 М MgSO4, 30 мМ HEPES, инсулина (1 мкг/мл) и 0,06 мМ аскорбиновой кислоты, рН скорректирован до 7,3. Отрегулируйте осмолярность до 310–330 осмоль с помощью осмометра.
- Отделите гиппокамп от всего мозга с помощью двух шпателей и разрежьте (400 мкм) с помощью тканевого измельчителя. Разделите срезы с помощью двух щипцов и перенесите вставки для клеточных культур диаметром 30 мм в 6-луночный планшет, заполненный питательной средой (950 μл) под вкладышами.
- Храните органотипические культуры срезов в инкубаторе для тканевых культур (35°C, 5%CO2) и меняйте среду для срезов каждые два дня.
2. Плазмидный препарат
- Подготовьте плазмиду для интересующего гена.
- Субклонируйте ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в вектор pCAG.
- Очистите плазмиду pCAG-EGFP с помощью набора для очистки, не содержащего эндотоксинов, и растворите во внутреннем растворе, состоящем из обработанной диэтилпирокарбонатом воды, содержащей 140 мМ K-метансульфоната, 0,2 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2 и 10 мМ HEPES, отрегулированного до pH 7,3 с помощью KOH (концентрация плазмиды: 0,1 мкг/мкл).
3. Приготовление стеклянной пипетки
- Натягивайте пипетки из боросиликатного стекла (4,5–8 МОм) на съемник микропипеток (рис. 1A).
заметка: Стеклянные пипетки, используемые для записи патч-клещей по всей ячейке, идеально подходят для электропорации.
- Выпекайте стеклянные пипетки в течение ночи при температуре 200°C для стерилизации.
- Проверьте размер наконечника пипетки под микроскопом для препарирования, чтобы приблизительно определить электрическое сопротивление.
- Дополнительно: Проверьте сопротивление пипетки, присоединив пипетку к электроду электропорации и с помощью микроманипулятора переместите наконечник пипетки в стерилизованную фильтром искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), содержащую (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 12PO4 и 11 глюкозу в деионизированной воде, газообразной с 5% CO2/95% O2до pH 7,4. Подтвердите фактическое сопротивление с помощью индикации на электропораторе.
заметка: Чем острее наконечник пипетки, тем больше электрическое сопротивление. Сопротивление пипетки должно быть ниже 10 МОм. Стеклянные пипетки с высоким сопротивлением пипеток (рис. 1B) часто засоряются на кончике во время многократной электропорации.
4. Установка электропорационной установки
- Установите электропоратор на стандартную электрофизиологическую установку с целыми ячейками, оснащенную вертикальным микроскопом, установленным на подвижном столе с микроманипулятором и перистальтическим насосом.
- Установите подставку электропоратора на микроманипулятор и подключите к электропоратору пару динамиков. Подключите электропоратор к ножной педали, которую можно использовать для отправки импульса><, когда все будет готово.
заметка: Динамики при включении издают тональный сигнал, который является индикатором электрического сопротивления на электроде. Это дает возможность определить относительные изменения сопротивления, не отвлекая внимание от процедуры.
5. Подготовка к электропорации
- Переложите вкладыши для срезов с 6-луночных планшетов в чашки Петри диаметром 3 см, загруженные 900 μл питательной среды, и храните в настольном инкубаторе CO2 до готовности к проведению электропорации.
- Предварительно инкубируйте вкладыши для свежих культур со средой для срезов (1 мл) в течение не менее 30 минут в чашке Петри диаметром 3,5 см для культивирования срезов после электропорации.
- Очистите и подготовьте установку к электропорации.
- Проведите на линиях 10% отбеливатель в течение 5 минут для стерилизации трубки и камеры перед началом эксперимента в течение дня.
- Пропитайте линии деионизированной автоклавной водой не менее чем на 30 минут для полной промывки.
- Перфузируйте линии с фильтрующим стерилизованным КСФ, содержащим 0,001 мМ тетродотоксина (ТТХ).<бр/>
заметка: ТТХ минимизирует клеточную токсичность и смерть из-за перевозбуждения интернейронов.
- Задайте параметры импульса электропоратора: амплитуду –5 В, квадратный импульс, последовательность 500 мс, частоту 50 Гц, длительность импульса 500 μс.
- Наполните стеклянную пипетку 5 мкл плазмидного внутреннего раствора.
- Удалите все захваченные пузырьки воздуха с наконечника дозатора, проведя по нему и осторожно постучав по нему несколько раз.
- Проверьте наконечник на наличие повреждений, визуализировав его под микроскопом для препарирования или повторив шаг 3.3.1 для проверки сопротивления пипетки.
заметка: Если наконечник поврежден, стеклянную пипетку необходимо выбросить, и этот шаг необходимо повторить с новой стеклянной пипеткой, предварительно подготовленной на шаге 3.
- Надежно прикрепите наконечник пипетки к электроду и включите динамики. Запишите показания (сопротивление пипетки) электропоратора, когда наконечник соприкоснулся со средой aCSF.
- Разрежьте мембрану вставки культуры с помощью острого лезвия и изолируйте один срез культуры. Осторожно перенесите культуру среза в камеру электропорации с помощью щипцов с острым углом и зафиксируйте ее положение с помощью анкера для среза.
- Не храните культуру срезов за пределами инкубатора более 30 минут за один раз, чтобы предотвратить побочные эффекты, такие как изменения в здоровье или функции нейронов.
6. Электропоратные ячейки, представляющие интерес
- Надавите положительным давлением на пипетку ртом или с помощью шприца объемом 1 мл (давление 0,2–0,5 мл), прикрепленного к трубке.
- Используйте 3-мерную ручку управления микроманипулятора для маневрирования наконечником пипетки вблизи поверхности культуры среза.
- Выберите клетку-мишень и приближайтесь к ней, сохраняя положительное давление до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется ямочка, видимая на микроскопе.
- Выполняйте циклы давления.
- Быстро надавите на небольшой негатив ртом, чтобы между наконечником пипетки и плазматической мембраной образовалось слабое уплотнение, на которое визуально указывает мембрана, немного поднимающаяся внутрь наконечника пипетки. Наблюдайте увеличение сопротивления пипетки (~ в 2,5 раза от начального сопротивления), прислушиваясь к увеличению тона, исходящего из динамиков. Быстро снова надавите на нее, чтобы ямочка снова образовалась.
- Немедленно завершите еще не менее двух циклов давления без паузы, затем удерживайте отрицательное давление в течение 1 с.<бр/>
заметка: Паузы между циклами, слишком большое давление или слишком долгое удержание отрицательного давления могут привести к значительному повреждению клетки и, возможно, к гибели клетки во время электропорации.
- Быстро импульсируйте электропоратор один раз с помощью ножной педали, когда тон из динамиков достигнет стабильной вершины высоты, указывающей на пиковое электрическое сопротивление. Не ждите на пике сопротивления более 1 с перед отправкой импульса.
заметка: Мы не наблюдали нецелевой электропорации при использовании этого протокола. Трансфицировали только клетки, контактировавшие со стеклянной пипеткой во время циклов давления. Расположение пипетки рядом с другими нейронами не приводит к трансфекции генов.
- Осторожно втяните пипетку примерно на 100 мкм от ячейки, не оказывая давления.
- Повторно приложите положительное давление, убедившись, что сопротивление аналогично зарегистрированному показателю на шаге 5.5, затем подойдите к следующей ячейке.
- Устраните потенциальные засоры, о которых свидетельствует визуально или значительно увеличенное (на >15% выше) сопротивление пипетки после электропорации, путем приложения положительного давления.
заметка: Если видимого засора нет, а сопротивление все же значительно выше, выбросьте пипетку и используйте новую. В среднем, пипетку можно использовать для проведения до 20 сеансов электропорации, если пользователь будет осторожен.
После электропорации переложите культуру среза на вкладыш для свежей культуры и инкубируйте при температуре 35°C в инкубаторе до 3 дней.
