$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Забор спинного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты должны быть автоклавированы (135 °C и 30 фунтов на квадратный дюйм для 4 x 7 мин циклов) для стерильности.
- Усыпить 1–3-дневных детенышей мышей C57BL/6 в камере с изофлураном. Подождите 30 с после прекращения движения и ущипните ногу, чтобы подтвердить отсутствие реакции.
- Отделите голову от тела с помощью ножниц, при этом щенок должен находиться в положении лежа.
- Стабилизируйте задние ноги или хвост и руки на процедурном столе спинной стороной к пользователю.
- Срежьте кожицу с помощью изогнутых ножниц по радужной оболочке.
- Разрежьте спинной мозг в поясничной области чуть выше бедер и приступайте к разрезу с обеих сторон грудной клетки, чтобы отделить ее от тела.
заметка: Это требует тщательного вскрытия спинного мозга от висцеральных органов, чтобы избежать непреднамеренного повреждения других органов (рисунок 1а).
- Вымойте последовательно в течение 10 с в чашках Петри размером 3 x 10 см, содержащих 5 мл 0,2 мкм стерилизованного фильтром физиологического буфера (PBS) для удаления излишков ткани.
- Введите иглу 22G и шприц, наполненные 5 мл стерилизованного фильтром PBS, в каудальный конец позвоночного столба и промывайте краниально, позволяя канатику выйти в четвертую чашку Петри (рис. 1b).
- Соберите спинной мозг в зонд объемом 15 мл с 5 мл HABG (Таблица 1). Соблюдайте осторожность, чтобы не раздавить спинной мозг.
- Повторите шаги 1.1–1.8 для каждого щенка в помете.
заметка: В идеале этот процесс должен занимать менее 30 минут на каждый спинной мозг, чтобы обеспечить здоровую изоляцию нейронов.
2. Изоляция нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг должен быть выполнен в колпаке с ламинарным потоком. Предполагается знакомство с базовой стерильной техникой
.
- Измельчение тканей
- Возьмите трубку, содержащую спинной мозг, и слегка встряхните, чтобы подвешивать ткань.
- Вылейте ткань из трубки в стеклянную чашку Петри диаметром 60 мм и нарежьте кубиками лезвием бритвы, чтобы получить мелкие кусочки размером ~0,5 мм.
- Перенесите ткань с помощью пипетки с широким отверстием в пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл HABG.
- Поместите его на водяную баню при температуре 30 °C на 30 минут, чтобы клетки могли уравновеситься при этой температуре. Держите клетки на шейкере ровно настолько, чтобы они могли быть подвешены в жидкости.
заметка: Этот шаг делается для того, чтобы избежать удара током клеток при переходе со льда в среду для пищеварения. Поддержание клеток при температуре 30 °C помогает снизить гибель клеток, связанную с повышенным метаболизмом при 37 °C.
- Приготовьте среду для варки (табл. 1).
- Подготовьте градиент плотности (табл. 1).
- Приготовьте каждый из 4 слоев в 4 отдельных пробирках объемом 15 мл, как показано в таблице 1.
- Добавьте по 1 мл с каждого слоя в новую пробирку объемом 15 мл. Начните со слоя 1 внизу и последовательно добавляйте, пока не дойдете до слоя 4 вверху. Не нарушайте слои во время добавления.
- Вымойте пластины с покрытием PDL. Промойте стерильной водой в течение нескольких минут, прежде чем удалить остатки воды и дать им высохнуть в течение 1 часа.
- Перенесите ткань в среду для переваривания.
- Извлеките содержащую ткань трубку из шейкера водяной бани при температуре 30 °C и дайте ей отстояться в течение нескольких минут.
- Извлеките трубку для пищеварения из водяной бани при температуре 37 °C и аспирируйте ее в шприц с фиксатором.
- Отсасывайте избыток HABG из тканесодержащей трубки.
- Используйте фильтр leur-lock 0,2 мкм на шприце, чтобы добавить питательную среду в тканевую пробирку.
- Поместите трубку на водяную баню при температуре 30 °C на 30 минут. Держите клетки в тряске ровно настолько, чтобы они могли быть взвешенными в жидкости><.
заметка: Важно не держать клетки в среде для переваривания слишком долго и не позволять температуре становиться слишком высокой, что может привести к чрезмерному перевариванию и привести к тому, что ткань станет взвешенной в студенистой смеси.
- В этот период обмазать ламинином.
- Выполните растирание (т.е. отделение клеток от ткани).
- Снимите трубку с водяной бани при температуре 30 °C и дайте ей отстояться в течение нескольких минут.
- Асасировать избыточную среду для переваривания.
- Суспензируйте ткань в 2 мл HABG.
- С помощью узкого дозатора растирать 10 раз в течение 45 с.<бр/>
заметка: Это, вероятно, самый важный шаг, который может значительно снизить урожайность, если не будет выполнен должным образом.
- Втяните ткань в пипетку и сразу же вылейте содержимое обратно.
- Избегайте подачи воздуха, так как это значительно снизит жизнеспособный урожай.
заметка: Идеальной пипеткой является стеклянная пипетка диагональю 9 дюймов. Кончик пипетки должен быть отполирован огнем, чтобы сгладить шероховатые поверхности. Затем его следует силиконизировать, поместив в раствор дихлордиметилсилана (DMDCS) в соотношении 1:20 в хлороформе и оставить O/N. Затем пипетку следует извлечь и дать ей высохнуть на воздухе. Впоследствии он должен быть автоклавирован для стерилизации.
осторожность: ДМДХН и хлороформ легко воспламеняются, поэтому силиконизацию следует проводить в вытяжном шкафу.
- Отберите верхние 2 мл надосадочной жидкости и поместите ее в новую пробирку объемом 15 мл с маркировкой «collection».
- Повторите шаги 2.7.3–2.7.5 еще два раза (к концу пробирки для сбора клеток должно быть 6 мл).
- Медленно перенесите содержимое сборной пробирки в градиентную пробирку, подготовленную на шаге 2.2, не допуская нарушения градиента.
- На этом этапе достаньте из холодильника заранее приготовленную нейробазальную среду (табл. 1) и дайте ей прогреться в ванне при температуре 37 °C.
- Очистите нейроны.
- Центрифугируйте градиентную пробирку в течение 15 минут при 800 x g и 22 °C.
- Соберите нужный слой (слои) с помощью пипетки (рисунок 2) и поместите в новую пробирку объемом 15 мл. Для выделения нейронов с самой высокой чистотой (т.е. >90%) соберите слой 3. Для получения большего урожая при меньшей чистоте (т.е. >70–80%) собирайте пласты 2 и 3.
- Разбавьте градиент плотности, добавив 5 мл HABG к вновь собранным слоям.
- Центрифугируйте при 200 x g в течение 2 мин при 22 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте в 5 мл HABG и взбейте гранулу, чтобы подвесить клетки.
- Центрифугируйте при 200 x g в течение 2 мин при 22 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте в 3 мл нейробазальной среды и взбейте гранулу, чтобы повторно суспендировать клетки.
| медиа | хранение | Ингредиенты | подготовка |
| HABG | 4 °C/24ч | | 100 мл | - Разморозьте B27 в холодильнике при температуре 4 °C O/N
- Фильтр стерилизующий (0,22 мкм) |
| Гибернация A | 97.8 мл |
| В27 [2%] | 2 мл |
| GlutaMAX [0,5 мМ] | 0.25 мл |
| Нейробазальные медиа | 4 °C/1 неделя | | 100 мл | - Разморозьте B27 в холодильнике при температуре 4 °C O/N
- Фильтр стерилизуется (0,22 мкм)
- Порции Aliquot 50 мл в пробирки по 50 мл (хранить при температуре 4 °C) |
| Нейробазальный А | 97 мл |
| В27 [2%] | 2 мл |
| GlutaMAX [0,5 мМ] | 0.25 мл |
| Перо/стрептококк [1%] | 1 мл |
| Среда для разложения | День изоляции | | 10 мл | - Энергично встряхните
- Оставьте в ванне при температуре 37°C на 30 минут (в идеале за 30 минут до использования)
- Фильтр стерилизующий (0,22 мкм) |
| HA-Ca | 10 мл |
| папаин | 25 мг |
| GlutaMAX [0,5 мМ] | 0.025 мл |
| Градиент плотности | День изоляции | | 1 Градиент | |
| слой | OptiPrep | ХАБГ |
| (0,13 мл) | (5,29 мл) |
| 1 Дно | 0,26 мл | 1,24 мл |
| 2 | 0,19 мл | 1,31 мл |
| 3 | 0,15 мл | 1,35 мл |
| 4 Наверх | 0,11 мл | 1,39 мл |
Таблица 1: Подготовка среды и растворов, используемых в этом протоколе.
