Децеллюляризация сердечно-легочного комплекса: методика децеллюляризации сердца и легких на мышиной модели

Аннотация

Источник: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Децеллюляризация мышиного сердечно-легочного комплекса. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует метод получения децеллюляризованного внеклеточного матрикса или каркасов ECM путем применения антеградной перфузии детергентов через сосудистую сеть. Структурные каркасы ЭКМ затем могут быть использованы для анализа ремоделирования ВКМ, связанного с сердечно-легочными заболеваниями.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Посмертная микрохирургия

1. Усыпьте мышь с помощью камеры CO₂.
   1. Поместите мышь в камеру объемом 4 л и начните заполнять ее 100%_CO2, начиная с 0,2 л/мин в течение 2 мин, увеличивая до 0,8 л/мин через 3 мин. Мышь должна потерять сознание в течение первых 2 мин, а затем дыхание должно прекратиться (обычно около 5 мин. но при необходимости поток можно поддерживать). Подтвердите смерть, прежде чем переходить к следующему шагу.
2. Выбрейте грудную клетку, брюшную полость и заднюю часть мыши машинкой для стрижки волос и продезинфицируйте 70% этанолом. Бритье значительно снижает количество артефактов благодаря наличию волос либо на образцах для визуализации, либо на биохимическом анализе.
3. Прикрепите мышь к лотку из полистирола, удлинив ее передние и задние конечности, а также голову и хвост. Поместите его под микрохирургический микроскоп.
4. С помощью ножниц прямого типа Майо установите хирургический доступ с помощью кожного разреза, идущего от подчелюстной области к нижней части живота, и подкожно рассекают, обнажая грудную стенку и брюшину.
5. С помощью микрохирургических ножниц разрежьте большую и малую грудные мышцы вдоль шестого межреберья по обе стороны от грудной стенки.
6. С помощью ножниц прямого типа разрежьте грудину вдоль предыдущих разрезов, а затем завершите стернотомию, разрезав грудину вдоль ее длинной оси, затем приподнимите и приколите обе стороны грудной стенки, чтобы обнажить сердечно-легочный комплекс.
7. С помощью микрощипцов с круглым концом (или микрощипцов Дюмона) иссеките тимус и окружающую жировую ткань, деликатно оттянув их от прикреплений. Это позволит выявить основные сосуды.
8. С помощью прижигания прижгите нисходящую кавальную вену и с помощью ножниц прямого образца разрежьте пищевод.
9. С помощью острых микрощипцов отделите брахиоцефальные вены и брахиоцефальные, левую общую сонную и левую подключичные артерии от подлежащих тканей для облегчения лигирования и прижигания.
10. С помощью микроиглодержателя, острых микрощипцов и шва 9-0 накладывают швы над возникновением брахиоцефальной, левой общей сонной и левой подключичной артерий.
11. Прижгите брахиоцефальные вены.
12. Отделите подчелюстные слюнные железы по средней линии, чтобы обнажить мышцы шеи и трахею. Разделите мышцы, чтобы обнажить пятищитовидную связку. С помощью микроножниц откройте вход, разрезав связку.
13. Введите катетер 27 G в трахею и осторожно надавливайте до тех пор, пока трахея не ответвится в бронхи (т. е. до тех пор, пока не будет достигнуто сопротивление катетеру, затем отступите на 3 мм). Будьте осторожны, чтобы не нарушить работу бронхов. С помощью шва 6-0 наложите 3 шва вокруг трахеи, чтобы зафиксировать катетер.
14. Разрез мыши на высоте 12-го грудного позвонка. Нисходящая аорта проходит спереди от позвоночника и должна быть разделена здесь вместе с позвоночником. Раздвиньте нижнюю половину.
15. Ретроградно катетеризируйте аорту и проталкивайте катетер до тех пор, пока он не достигнет дуги аорты. С помощью шва 9-0 наложите 4 шва вокруг аорты, начиная на 5 мм ниже кончика катетера.

2. Децеллюляризация

1. Подключите мышь к насосной системе с помощью силиконовых трубок и разъемов Люэра. Перфузировать деионизированной водой со скоростью 200 мкл/мин в течение 15 мин. Поддерживайте эту скорость потока во время децеллюляризации.
2. Замените перфузионный агент на 0,5% дезоксихолат натрия (DOC), разведенный в деионизированной воде, и перфузируйте в течение ночи.
3. Замените перфузионный агент на 0,1% додецилсульфат натрия (SDS), разведенный в деионизированной воде, и перфузируйте в течение 8 часов.
4. Перфузируйте деионизированной водой в течение ночи, чтобы смыть SDS и DOC в течение 24 часов.
5. Децеллюляризированное сердце и легкие резецируют путем разрезания его прикреплений к грудной клетке с помощью изогнутых ножниц и хранят в стерильной криопробирке с деионизированной водой с 1% (v/v) пенициллин-стрептомицина и 0,3 мкМ азида натрия при 4 °C. Каркасы ECM можно хранить не менее 12 недель. Если каркас будет использоваться для биохимического анализа (например, масс-спектрометрии), заморозьте его в жидком азоте.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
микрохирургия
6-0 шовный материал, игла треугольного сечения (Викрил)	Этикон	6301124
9-0 микрошовный материал (Safil)	Б. Браун	G1048611
Щипцы Адсона	Инструменты для точной науки	11006-12
Щипцы Адсона с зубьями	Инструменты для точной науки	11027-12
Держатель микроигл Castroviejo	Инструменты для точной науки	12061-01
Вентиляционная камера CO2 для эвтаназии мышей
Деионизированная вода (Milli-Q IQ 7000, система сверхчистой лабораторной воды)	Мерк	ZIQ7000T0
Одноразовый лоток из полистирола (~30 × 50 см)
Диссекционный микроскоп (Гриноу, с двуручным гусиным шеем)	Лейка	С6 Д
Двусторонний микрошпатель	Инструменты для точной науки	10091-12
Микрощипцы Dumont (два)	Инструменты для точной науки	11252-20
Микрощипцы Dumont с наконечниками под углом 45°	Инструменты для точной науки	11251-35
Машинки для стрижки волос	Остер	76998-320-051 (Английский
Иглодержатель Halsey (с губками из карбида вольфрама)	Инструменты для точной науки	12500-12
Внутривенный катетер 24-го калибра (Insyte)	БД	381512
Внутривенный катетер 26-го калибра (Terumo)	Серфло-В	СР+DM2619WX
Ножницы Майо (жесткий крой, прямые)	Инструменты для точной науки	14110-15
Микрощипцы с кольцевыми кончиками	Эскулап	ФМ571Р
Ножницы с микропружинами (Vannas, изогнутые)	Инструменты для точной науки	15001-08
Иглы (27 калибр; Микроланс)	БД	21018
Бумажное полотенце (стерильное) или хирургическая салфетка
Зубчатые ножницы (CeramaCut, прямые)	Инструменты для точной науки	14958-09
Шпатель (Фрир-Ясаргиль)	Эскулап	ОЛ166Р
Шприцы (1 мл; Пластипак)	БД	3021001
Шприцы (10 мл; Пластипак)	БД	3021110
Сухожильные ножницы (Walton)	Инструменты для точной науки	14077-09
ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИЯ
70% этанола (абсолютный спирт 99,9%); абсолютный спирт должен быть доведен до 70% (об/об.) с помощью деионизированной воды	слива	1680766
Деионизированная вода (Milli-Q IQ 7000, система сверхчистой лабораторной воды)	Мерк	ZIQ7000T0
Фитинги с наружной резьбой Люэра на трубку (1/8 дюйма)	Мировые прецизионные приборы	13158-100
Фитинги с наружной резьбой Люэра на трубку (1/8 дюйма)	Мировые прецизионные приборы	13158-100
PBS (pH 7,4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140122
Перистальтический насос (с 12 каналами)	Оле Дич	110AC(R)20G75
Силиконовая трубка (с внутренним диаметром 2 мм и наружным диаметром 4 мм)	Оле Дич	No 31399
Азид натрия	Сигма-Олдрич	08591-1МЛ-Ф
Дезоксихолат натрия (DOC)	Сигма-Олдрич	Д6750-100Г

гг. ) г.