Выделение эпителия циркумваллятных сосочков (CVP) из мышиной модели: ферментативная процедура отделения эпителия CVP от языка мыши

Аннотация

Источник: Shechtman, L. A. et al. Генерация и культура лингвальных органоидов, полученных из стволовых клеток вкуса взрослой мыши. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы описываем выделение эпителия вокруг околососочковых сосочков (CVP) из языка мыши.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Выделение эпителия CVP

1. Усыпляйте мышей с помощью асфиксии CO₂ в соответствии с правилами IACUC с последующим использованием одобренного вторичного метода, такого как двусторонняя торакотомия, вывих шейки матки, обезглавливание или обескровливание.
2. Используйте большие стерильные ножницы для вскрытия, чтобы разрезать щеки и сломать челюсть. Поднимите язык и разрежьте уздечку языка, чтобы отделить язык от дна ротовой полости. Вырежьте язык и соберите его в стерильный ледяной фосфатно-солевой буфер Дульбекко (dPBS) с Ca²⁺ и Mg²⁺.
3. Удалите и выбросьте передний язык, разрезав лезвием бритвы прямо перед межмолярным возвышением (Рисунок 1А, пунктирная линия). С помощью деликатной салфетки удалите волосы и лишнюю жидкость с заднего языка.
4. Наполните 1 мл шприца 200–300 μл раствором инъекционного фермента (конечная концентрация: 2 мг/мл коллагеназы типа I и 5 мг/мл Dispase II в Ca²⁺/Mg²⁺-содержащий dPBS, разбавленный из 10 мг/мл стоковых растворов) и вставьте иглу 30 г x 1/2 чуть выше межмолярного возвышения (рисунок 1B, черной стрелкой) до момента расположения непосредственно перед CVP (рисунок 1B, черный ящик). Введите ферментный раствор под и на боковые края CVP между эпителием и нижележащими тканями (собственной пластинкой, мышцами). Медленно и непрерывно извлекайте шприц из языка во время выполнения инъекции.
5. Инкубируйте язык в стерильном Ca²⁺/Mg²⁺-free dPBS при комнатной температуре ровно 33 минуты.
6. Сделайте небольшие надрезы в эпителии с обеих сторон и непосредственно перед ЦВД с помощью ножниц для тонкого рассечения, и аккуратно отшлифуйте эпителий, приподняв его тонкими щипцами. Как только эпителий траншеи освободится от подлежащей соединительной ткани, поместите его в пустую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, предварительно покрытую FBS. Проведите обрезку эпителия до или после отсоединения эпителия CVP (рис. 1C, D).

Результаты

Рисунок 1: Рассеченный язык и отшелушившийся эпителий CVP. (A) Язык рассекается, а передний язык удаляется путем разрезания прямо перед межмолярным возвышением (пунктирная линия), оставляя задний язык, который включает в себя CVP (черный ящик) (B) Игла вводится прямо перед межмолярным возвышением (черная стрелка), и ферментная смесь вводится ниже и к ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл шприца TB	Шприц BD	309659
Фосфатный буферный раствор Дульбекко с Ca²⁺ и Mg²⁺	Gibco	10010-023
Фосфатный буферный раствор Дульбекко с Ca²⁺ и Mg²⁺	Сигма Медико-биологические науки	Д8662-500МЛ
Щипцы Dumont #5	Инструменты для точной науки	11252-30
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	26140-079
1 мл шприца TB	Шприц BD	309659
Микроцентрифужные пробирки 2,0 мл	США Сайентифик	1420-2700
Хирургические ножницы - острые	Инструменты для точной науки	14002-14
Сверхтонкие боннские ножницы	Инструменты для точной науки	14084-08
Таймер / секундомер с большими цифрами	Научный центр Фишера	S407992
Стереомикроскоп	Цейсс	Stemi SV6
Весенние ножницы Cohan-Vannas	Инструменты для точной науки	15000-02
Коллагеназа из Clostridium histolyticum, тип I	Сигма Лайф Сайнс	С0130-1Г
Диспаза II (нейтральная протеаза, степень II)	Сигма-Олдрич (Рош)	4942078001

гг.