$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление микропузырьков
- Подготовка микропузырьков для инъекций
заметка: Ассистент выполняет этот шаг, когда начинается «Введение микропузырьков (MB) в эмбрионы». Каждый эмбрион вводится один раз, при этом тип микропузырьков, выбранный для каждой инъекции, выбирается ассистентом случайным образом таким образом, чтобы все типы микропузырьков были равномерно распределены на протяжении всей процедуры, но подавались в случайном порядке. Убедитесь, что хирург не обращает внимания на тип вводимого пузыря.
- Определите объем исходного пузырькового раствора, необходимый для получения конечной концентрации 1 x 108 МБ/мл в объеме 400 мкл (рассчитайте объем с использованием исходных концентраций). Выложите соответствующий объем физиологического раствора в пустую микроцентрифужную пробирку.
- Осторожно перемешайте выбранный флакон с микропузырьками и наберите лишний объем (~50 мкл больше рассчитанного выше) раствора в шприц объемом 1 мл с помощью иглы 21 G. Введите микропузырьки в пустую микроцентрифужную пробирку.
- Пипеткой наберите необходимый объем микропузырькового стокового раствора и добавьте в аликвоту физиологический раствор. Перемешайте, осторожно помешивая кончиком пипетки.
- Наберите разведенный раствор микропузырьков в чистый шприц с помощью иглы 21 G. Сняв иглу, удалите из шприца любые пузырьки воздуха и прикрепите люэр и трубку. Медленно протолкните раствор до конца трубки, следя за тем, чтобы в нем не образовывались пузырьки воздуха.
- Вставьте шприц в набор инфузионных насосов для шприца, чтобы дозировать микропузырьки со скоростью 20 мкл/мин при общем объеме 20 мкл. Прикрепите вытянутую стеклянную иглу к концу трубки. Переместите насос ближе к стадии впрыска
.
2. Введение микропузырьков в эмбрионы
- Произвольно выберите и удалите (перфорированной ложкой) один эмбрион из охлажденной формы для фильтрующего материала. Поместите в диссекционную чашку, расположенную на ультразвуковом предметном столике под стереоскопом, и удалите желточный мешок и околоплодные оболочки тонкими щипцами, разрезая/разрывая с той стороны, которая кажется наименее васкуляризированной (антиметровая сторона). Проще всего этого добиться путем прокалывания области, прилегающей к области головы.
- Срезать достаточно, чтобы извлечь зародыш изнутри, но не более. Стабилизируйте посуду для вскрытия с помощью небольших кусочков пластилина.
- Аккуратно перемещайте мешочек вокруг эмбриона. Расположите эмбрион на боку, так, чтобы плацента и пупочные сосуды находились впереди. С помощью булавок от насекомых приколите желточный мешок (рекомендуется 4 булавки) и края плаценты по мере необходимости, чтобы закрепить на месте. Избегайте крупных судов.
- Промойте эмбрион предварительно подогретым до 45°C PBS до тех пор, пока эмбрион не оживет. Определите пупочную вену и связанную с ней сосудистую сеть. Расположите чашку так, чтобы можно было удобно делать инъекцию.
заметка: После нагревания кровь в эмбрионе начнет течь, заметно перекачиваясь в пупочной артерии. Когда кровотечения только начинаются, вены будут ярко-красными, а кровь в обоих сосудах быстро станет идентичной. Ветви, выходящие из пупочной вены, обычно перекрывают ветви, исходящие от пупочной артерии на плацентарной поверхности.
- Как только эмбрион оживет, накройте его (но не плаценту) предварительно подогретым гелем США, осторожно удалив все пузырьки воздуха (с помощью тонких щипцов) вокруг эмбриона. Долейте в блюдо предварительно подогретый PBS. <бр/>
заметка: Следите за уровнем раствора в PBS и гелевых шприцах и при необходимости добавляйте резервные шприцы в нагревательный стакан.
- Установите стеклянную иглу на большой шарик из пластилина на краю чашки для препарирования и вставьте конец иглы в PBS. Выбрав вену на хорионической поверхности плацентарного диска, как можно дальше от основной ветви, подрежьте кончик по размеру с помощью ножниц. Инъекция выполняется проще всего, если кончик срезан под небольшим углом. Удалите все зазубренные края стекла с помощью края пружинных ножниц.
- С помощью шприцевого насоса медленно вводите раствор микропузырьков со скоростью 20 мкл/мин в стеклянную иглу до тех пор, пока весь воздух не будет вытеснен из кончика иглы и не будет видно, как микропузырьки свободно поступают в PBS. Остановите насос и сбросьте его на объем впрыска 20 μл. Не допускайте попадания воздуха в сосудистую систему эмбриона во время инъекции.
- Осторожно введите кончик стеклянной иглы в одну из вен плаценты и убедитесь, что она неподвижна. Откиньте головку стереоскопа и расположите датчик над эмбрионом. Инициируйте визуализацию.