Выделение комменсальных бактерий конъюнктивы на основе мазка: метод выделения комменсальных бактерий из конъюнктивы мышиной модели

Аннотация

Источник: Smith-Page, K. et al. Изоляция и идентификация комменсальной конъюнктивы у мышей. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео описывается метод выделения жизнеспособных комменсальных бактерий из глазной конъюнктивы с помощью мазка. Этот метод может быть использован для профилирования комменсального бактериального микробиома конъюнктивы, которая играет защитную роль против патогенов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка мазка из глаза, подготовка рабочего поля, взятие мазка из глаз мыши и обогащение образцов

1. Подготовьте стерильные мазки из глаз
   заметка: Стерильные тампоны для глаз представляют собой тонко покрытые деревянными зубочистками с волокном тонкого слоя ватина и изготовленные в домашних условиях.
   1. Автоклав имеет соответствующее количество ватного ватина и зубочисток для количества мышей, которые должны быть взяты мазком.
   2. Отщипните кусочек ватина длиной в полсантиметра большим и указательным пальцами. Вытягивайте ватин, потянув за края большими и указательными пальцами, чтобы образовался плоский одинарный пористый слой, останавливаясь непосредственно перед тем, как ватин развалится (небольшие кусочки ватина, разбросанные по всему растянутому ватину, допустимы).
   3. Обмотайте ватин вокруг одного из острых концов зубочистки, слегка удерживая вытянутый кусок на кончике зубочистки, когда он скручивается, см. рисунок 1. «Готовый» мазок из глаз будет иметь очень тонкий слой ваты, натянутый на кончик, простирающийся примерно от половины до одного сантиметра от кончика.
   4. Вставьте «готовые» тампоны в маленькую мензурку тампоном вниз и накройте крышкой. Автоклав.
2. Настройка рабочего пространства
   1. Приготовьте анестезию, содержащую 2 мл кетамина (100 мг/мл), 400 мкл ксилазина (100 мг/мл) и 27,6 мл стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl в dH₂O) в стерильной стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл. Фильтр стерилизует и обезболивает аликвотой для немедленного использования (можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 месяца; перед использованием всегда дайте отбалансироваться до комнатной температуры).
   2. Очистите и очистите рабочую зону с помощью дезинфицирующего средства, чтобы свести к минимуму загрязнение.
   3. Введите 0,5 мл стерильной среды для инфузионной терапии мозга и сердца (BHI) в меченые 1,5 мл стерильных микроцентрифужных пробирок (по 1 пробирке на мышь и контрольную мышь); разложите в микроцентрифужной штативе. Установите решетку на лед.
   4. Настройте рабочий процесс следующим образом (слева направо): станция обезболивания мышей (клетка с экспериментальными мышами, пустая стерильная клетка, анестезия комнатной температуры, игла 25 г и шприц 1 мл), станция для взятия мазков из глаз (аликвотированный BHI на льду, стерилизованные глазные тампоны, чистые бумажные полотенца, 70% изопропаноловый спрей) и станция для нанесения покрытий (агаровые пластины для крови комнатной температуры, пипетка объемом 10 мкл, 10 мкл стерильных одноразовых наконечников, контейнер для биологически опасных отходов).
3. Мазок из глаз
   1. Введите 10 мкл анестезии на 1 г мышиной массы в дозе кетамина и ксилазина соответственно внутрибрюшинно каждой взрослой мыши и поместите в автоклавную клетку. Протестируйте обезболивание путем сдавливания подушечки заднего лапы; Отсутствие движения указывает на соответствующую анестезию.
   2. Назначьте одну руку работать только с мышами под наркозом, а другую — только с мазком из глаза и бактериологическим исследованием. Для взятия мазка извлеките полностью обезболенную мышь из клетки; Положите на чистую рабочую поверхность на бок с открытым левым глазом. Опрыскайте руки в перчатках изопропанолом, высушите чистым бумажным полотенцем.
   3. Снимите крышку со специальной маркировкой микроцентрифужной пробирки BHI со специальной рукой для работы с фильтрующим материалом. Поместите пробирку обратно в штатив для микроцентрифуг на льду. Окуните ватный наконечник тампона из глазного тампона в BHI, извлеките тампон из пробирки, проведя кончиком 2 раза по внутренней трубке, чтобы удалить лишнюю жидкость.
   4. Рукой для работы с мышью аккуратно держите мышь за загривок. Другой рукой приложите кончик тампона к медиальной конъюнктивальной области левого глаза, см. рисунок 2А. Слегка надавите на глазное яблоко и переместите тампон движениями для мытья окна (рисунок 2B) вперед и назад, между нижним веком и глазом, 10 раз. Поддерживайте постоянное давление.
   5. Не касаясь меха, аккуратно снимите кончик тампона перпендикулярно тому месту, куда он был введен, и поместите ватную сторону тампона вниз прямо в маркированную микроцентрифужную пробирку, содержащую среду BHI. Нанесите смазывающие глазные капли на тампон из глаза.
   6. Верните мышь в клетку.
   7. Дайте тампону постоять на льду от 10 до 15 минут и удалите мазок из глаз стерилизованной рукой в перчатке, перемешивая наконечник в среде в течение 10 оборотов. Извлеките тампон, повернув наконечник к внутренней стенке микроцентрифужной пробирки на 5 оборотов. Выбросьте тампон в контейнер для биологически опасных веществ.
   8. Повторите шаги с 1.3.2 по 1.3.7 для каждой мыши и для контрольных образцов (тампон из кожи или меха). Стерилизуйте перчатки соответствующим образом между каждым тампоном.
4. обогащение
   1. Обогатите образец путем статической инкубации пробирки в течение 1 ч при 37 °C
   2. Во время инкубации наклейте на одну комнатную температуру Триптиказу сою 5% агаровой тарелкой овечьей крови (тарелка TSA) на каждую мышь и разделите пополам.
   3. После инкубации посева мазка из глаз извлеките обогащенные образцы из инкубатора и поместите на лед.
   4. Кратко перемешайте вихревые образцы и нанесите пластины в соответствии со схемой на рисунке 3А. Нанесите 10 мкл образца на планшет TSA и наклоните пластину до образования полоски, повторите 2 раза.
   5. С другой стороны разделительной линии пластины нанесите 10 мкл образца на агар, повторите 9 раз.
   6. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение 18 часов, 2 дней и 4 дней (в чистой камере, предотвращающей высыхание агаровых пластин). Подсчитайте колонии полосками, обратите внимание на морфологию и рассчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) на мазок для морфологически сходных изолятов. Посмотрите на точки для уникальных организмов, не захваченных полосками.

Результаты

Рисунок 1: Мазок из глаз на месте.
(А) Тонкий, примерно 1 см, кусок натянутого ватина помещался между стерильным острием зубочистки и указательным пальцем, и зубочистка сворачивалась, сохраняя небольшое давление на указательный палец, до тех пор, пока вата полностью не скатывалась на кончик зубочистки. (B) Пример мазка из глаза.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Наконечник для дозатора от 0,1 до 10 мкл	США Сайентифик	1110-300	Автоклав перед использованием
от 0,5 до 10 μл пипетки Eppendorf	Научный центр Фишера	Тел.: 13-690-026
1 мл шприц	Научный центр Фишера	BD309623	1 шприц на каждую группу мазков из глаз
Пробирки Eppendorf 1,5 мл	США Сайентифик	1615-5500	Автоклав перед использованием
1000 μ мл наконечник для пипетки	США Сайентифик	1111-2021	Автоклав перед использованием
От 200 до 1000 μл пипетки Жильсона (P1000)	Научный центр Фишера	F123602G
Игла 25 г	Научный центр Фишера	14-826АА	1 игла на группу тампонов из глаза
3 % перекись водорода	Научный центр Фишера	С25359
Инкубатор 37 °	Лабораторное оборудование
70 % изопропанол	Научный центр Фишера	ПХ1840-4
Ана-Сед для инъекций (Ксилазин 100 мг/мл)	Санта-Крус Здоровье животных	SC-362949Rx
Горелка Бунзена	Лабораторное оборудование
Чистые бумажные полотенца	Лабораторное оборудование
Ватин хлопчатобумажный/Стерильный хлопчатобумажный	CVS
Кетамин (100 мг/мл)	Генри Шейн	9950001
Мышей	Лаборатории Джексона	С57/БЛ6Дж
Чашки Петри	Научный центр Фишера	Тел.: 08-757-12	Для агаровых пластин с маннитовой солью
RPI Среда для инфузионной терапии мозга и сердца	Научный центр Фишера	50-488525	Подготовка в соответствии с инструкцией и автоклавирование
SteriFlip (полиэфирсульфон размером пор 0,22 мкм)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	Для стерилизации анестезии
Стерильная клетка для мышей	Лабораторное оборудование
Зубочистки (круглый бамбук)	Кухонные принадлежности		Автоклав перед применением и подготовка мазка
Триптиказ соевый агар II с 5% пластинами овечьей крови	Научный центр Фишера	4321261	Хранить при температуре 4 °C до готовности к употреблению
Одноразовые глазные капли	CVS Аптека		Глазные капли Bausch and Lomb Soothe Soothe, 28 флаконов, 0,02 жидких унций каждый

гг. гг. C