$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка мыши
- Обезболивание мыши
- Приготовьте пентобарбитал натрия (50 мг/кг) в шприце.
- Возьмитесь за мышь (8-недельный самец C57BL/6) левой рукой так, чтобы ее живот был обращен вверх, а голова была ниже хвоста. Продезинфицируйте кожу живота 75% спиртом.
- Держа шприц в правой руке, проколите иглой белую линию живота немного правее кожи на 3–5 мм. Следите за тем, чтобы игла шприца и кожа находились под углом 45°, медленно вводите пентобарбитал в брюшную полость. После бритья дезинфицирует вокруг места разреза мыши 3 раза поочередно 75% спиртом и раствором хлоргексидина.
- Проверить, была ли анестезия успешной, можно по отсутствию выпрямляющего рефлекса.
- Введите родамин В изотиоцианат-декстран в каудальную вену.
- Приготовьте в шприце 100 мкл 10 мг/мл родамина B изотиоцианата-декстрана.
- Протрите хвост мыши 75% спиртом.
- Левой рукой придерживайте хвост, в правой руке держите шприц иглой параллельно вене, и введите краситель объемом 100 μл.
- Остановите кровотечение ватным тампоном после инъекции.
- Смочите брюшной мех мыши марлей, смоченной в стерильной воде, и побрейте брюшную полость мыши с помощью бритвы, делая поглаживания по направлению меха. После бритья 3 раза дезинфицирует вокруг места разреза мыши поочередно 75% спиртом и раствором Хлоргексидина.
- Протерев грелку 75% спиртом, откройте грелку и положите мышь на спину в грелку, чтобы поддерживать температуру ее тела на уровне 37 °C.
2. Фиксация печени мыши с помощью рамки для визуализации органов тела
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая рамка для визуализации органов еще не выпущена.
- Установите чистую присоску в неподвижное положение.
- Установите приспособление для визуализации органов (рис. 1) и протрите грелку и присоску 75% спиртом.
- Подсоедините присоску (диаметр 5 мм) к шлангу вакуумного насоса и включите вакуумный насос.
- На стерильном столе стерилизуют 75% спиртом, дезинфицируют вокруг места разреза мыши 3 раза поочередно 75% спиртом и раствором Хлоргексидина, затем 3 раза дезинфицируют вокруг места разреза мыши поочередно 75% спиртом и раствором Хлоргексидина, затем хирургическими ножницами срезают 2 см кожи с нижней границы грудины мыши и обнажают печень.
- Поместите мышь вместе с грелкой на основание держателя.
- Отрегулируйте приспособление для визуализации органов так, чтобы присоска удерживала печень. Затем используйте отрицательное давление 30–35 кПа для отсасывания, чтобы печень прикрепилась к присоске (рис. 2).
3. Настройка многофотонного лазерного сканирующего микроскопа
- Включите многофотонный микроскоп и выберите объектив 60x/1,00 Вт.
- Закрепите рамку и мышь под объективом.
- Добавьте каплю обычного физиологического раствора, которая может покрыть всю линзу, которая является центром присоски, и отрегулируйте линзу объектива так, чтобы она касалась только обычного физиологического раствора.
- Дважды щелкните по значку компьютера, чтобы включить лазерное программное обеспечение, и включите переключатель. Затем нажмите и удерживайте кнопку включения и спуска затвора в течение 3 секунд.
- Установите длину волны на 800 нм.
- Запустите операционное программное обеспечение микроскопа с помощью компьютера.
- В качестве параметра Сбор данных установите Лазер 800.
